α-1，2-甘露糖苷酶在毕赤酵母突变菌株中的克隆表达

论文摘要

酵母表达系统已经被广泛应用于多种重组蛋白的表达。酵母对蛋白的糖基化修饰过程不同于哺乳动物,其特点为产生高甘露糖型糖基且易发生过度糖基化。本研究是毕赤酵母糖基化改造工作中的一个重要组成部分。目的是通过引入α-1,2-甘露糖苷酶（MDSI）将毕赤酵母宿主表达外源糖蛋白N-糖链由Man8GlcNAc2结构削剪为Man5GlcNAc2结构。α-1,2-甘露糖苷酶来源于各种真核生物,属于典型的Ⅱ型膜蛋白,只专一的作用于α-1,2连接的甘露糖。要使MDSI有效发挥作用,需将其定位在Man8GlcNAc2 N-聚糖形成但尚未到达酵母糖基转移酶（主要是甘露糖转移酶和磷酸甘露糖转移酶）作用范围的位置,即定位在内质网或内侧高尔基体。只有正确定位在酵母分泌途径的合适区域甘露糖苷酶才能发挥其在胞内对底物的作用,因此筛选了3种定位信号,即编码酿酒酵母MnsI基因的内侧高尔基体定位信号、酿酒酵母Secl2基因的内质网定位信号以及乳酸克鲁维酵母Secl2基因的内质网定位信号。本研究选用了两种来源的MDSI基因分别为——人源的（Homo sapiens）和拟南芥来源的（Arabidopsis thaliana）,并去除其自身穿膜锚定区或自身穿膜锚定区和干区,得到4种MDSI基因片段:Hmdsi（Δ63）、Hmdsi（Δ185）、ATmdsi（Δ48）、ATmdsi（Δ80）。通过与上述3种定位信号的组合,最终共获得12种不同MDSI表达载体,并转化毕赤酵母突变菌株GJK01。最后利用荧光辅助糖电泳（FACE）的方法对其报告蛋白HSA/GM-CSF的糖基结构进行分析。结果初步显示,以MnsI为定位信号,拟南芥来源的MDSI可以在酵母中发挥作用,即可将外源糖蛋白N-糖链由Man8GlcNAc2结构削剪为Man5GlcNAc2结构。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 引言
• 第一章 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 工具酶、抗体及分子量标准
• 1.3 主要试剂及试剂盒
• 1.4 主要仪器
• 1.5 主要培养基
• 1.6 主要溶液
• 第二章 实验方法
• 2.1 表达载体pGEURA3-GAP的构建
• 2.1.1 基因的克隆
• 2.1.2 表达载体构建
• 2.1.3 启动子功能验证
• 2.2 MDSI基因的扩增
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 基因扩增
• 2.3 定位表达载体pGEURA3-GAP1-MDSI的构建
• 2.3.1 pGEURA3-GAP载体酶切位点的更换
• 2.3.2 定位载体pGEURA3-GAP1-Leader的构建
• 2.3.3 定位表达载体pGEURA3-GAP1-MDSI的构建
• 2.4 MDSI在毕赤酵母突变菌株GJK01-HSA/GM-CSF（His）中的表达
• 2.4.1 pGEURA3-GAP1-MDSI的电转化
• 2.4.2 转化子的筛选
• 2.5 MDSI在毕赤酵母突变菌株GJK01-HAS/GM-CSF（His）中表达的鉴定
• 2.5.1 报告蛋白HSA/GM-CSF（His）的表达
• 2.5.2 报告蛋白HAS/GM-CSF（His）的纯化
• 2.5.3 报告蛋白HSA/GM-CSF（His）N-糖链的FACE分析:
• 第三章 实验结果
• 3.1 表达载体pGEURA3-GAP的构建
• 3.1.1 基因的克隆
• 3.1.2 表达载体pGEURA3-GAP的构建
• 3.2 表达载体pGEURA3-GAP功能验证
• 3.2.1 表达载体pGEURA3-GAP-HSA/GM-CSF的构建
• 3.2.2 HSA/GM-CSF在毕赤酵母JC307中的表达
• 3.2.3 毕赤酵母JC307表达的HSA/GM-CSF活性检测
• 3.3 定位信号基因及MDSI基因的扩增
• 3.4 定位表达载体pGEURA3-GAP1-MDSI的构建
• 3.4.1 pGEURA3-GAP1-Leader的构建
• 3.4.2 pGEURA3-GAP1-MDSI的构建
• 3.5 MDSI在毕赤酵母突变菌株GJK01-HSA/GM-CSF（His）中的表达与鉴定
• 3.5.1 转化子的筛选
• 3.5.2 报告蛋白HSA/GM-CSF（His）的表达
• 3.5.3 报告蛋白HAS/GM-CSF（His）的纯化
• 3.5.4 报告蛋白HSA/GM-CSF（His）N-糖链的FACE分析:
• 第四章 讨论
• GAP的应用'>4.1 组成型启动子P_GAP的应用
• 4.2 MDSI的正确定位与活性发挥
• 4.3 报告蛋白N-糖基的分析方法
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介