几丁质合成酶及其抑制剂的研究

论文摘要

几丁质是真菌细胞壁的重要成分之一,具真菌特异性,由几丁质合酶(chitin synthase,CS)催化合成。真菌中存在7类CS,不同真菌的CS同功酶种类各不相同。酵母类仅有Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ类CS,其中Ⅱ和Ⅳ类具重要的生物学功能。丝状真菌往往有7类CS,其中Ⅲ,Ⅴ,Ⅵ类具重要的生物学功能。研究真菌抑制剂对于真菌病害防治有重要意义。本研究以酿酒酵母YFK32为指示菌株,通过96孔板法筛选到若干具有抑制酵母作用的微生物菌株,用滤纸片法发现了若干中药提取物具有明显的抑制酵母生长作用。Calcofluor white(荧光增白剂)能抑制酿酒酵母的生长,而这种生长抑制能被CS抑制剂解除的机理,本研究用YFK32为指示菌株,以CS作为筛选靶标,在平板中加入具抑制浓度的calcofluor white,然后观察平板中加样点附近酵母生长圈进行正筛选。通过该方法得到了若干个可能是CS抑制剂的中药提取物。由于不同抑制剂针对不同的CS同功酶,仅含有一个CS基因的缺陷型酵母比野生型酵母对靶标抑制剂更加敏感。为更精确了解筛选获得的抑制剂的作用机理,我们通过敲除chs1和chs3,构建了仅含有CS2的缺陷型酵母。但是通过检测发现这些中药提取物不是CS2的特异性抑制剂。这些中药提取物的抑制作用仍需进一步研究。此外,为更好了解丝状真菌的CS功能。本研究通过PCR扩增灰霉chs V基因上、下游各1.5kb和1.3kb的同源序列,并利用合适的内切酶将同源序列构建至pAG32质粒的潮霉素抗性基因(HygB)两侧,形成基因敲除构件(Gene Disruption Cassette)。为提高基因敲除效率,本研究将基因敲除构件亚克隆至双元载体中,并将之转化农杆菌,通过农杆菌介导法对灰霉基因进行敲除。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 真菌几丁质合酶的研究进展
• 1.1 前言
• 1.2 真菌几丁质合酶基因
• 1.3 几丁质合酶的分类与结构
• 1.4 几丁质合酶的生物学功能
• 1.5 几丁质合酶与致病性的关系
• 1.6 展望
• 参考文献
• 第二章 几丁质合酶抑制剂正筛选模型的建立
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株、培养基和试剂
• 2.2.2 双层平板的制备
• 2.2.3 菌株YFK32对CFW敏感性测定
• 2.2.4 几丁质合酶抑制剂增加酵母对CFW的抗性
• 2.2.5 几丁质合酶抑制剂的正筛选
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 CFW对YFK32的抑制作用
• 2.3.2 几丁质合酶抑制剂正筛选模型的建立
• 2.3.3 正筛选模型灵敏度测试
• 2.4 展望
• 参考文献:
• 第三章 酵母几丁质合酶抑制剂负筛选模型的构建
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株、质粒、引物、培养基和试剂
• 3.2.2 重叠PCR构建基因敲除构件（Gene Disruption Cassette）
• 3.2.3 基因敲除质粒的构建
• 3.2.4 酿酒酵母感受态的制备和转化
• 3.2.5 克隆PCR鉴定
• 3.2.6 几丁质合酶基因敲除酵母的构建
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 PCR合成几丁质合酶基因敲除构件
• 3.3.2 基因敲除质粒的构建
• 3.3.3 基因敲除酵母菌株的构建
• 3.3.4 突变子的表型鉴定
• 3.4 展望
• 参考文献:
• 第四章 几丁质合酶抑制剂的筛选
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株、培养基和试剂
• 4.2.2 96孔板法筛选抗真菌活性物质
• 4.2.3 滤纸片法筛选中药提取物的抗真菌活性物质
• 4.2.4 正筛选法筛选几丁质合酶抑制剂
• 4.2.5 抑制剂的靶标性分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 96孔板筛选抑制剂
• 4.3.2 滤纸片法筛选几丁质合酶
• 4.3.3 正筛选法对中药提取物进行筛选
• 4.3.4 抑制剂的靶标性分析
• 4.4 展望
• 参考文献:
• 第五章 灰霉几丁质合酶chs V的功能研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株、质粒、培养基、试剂和引物
• 5.2.2 灰霉基因组DNA的提取
• 5.2.3 灰霉几丁质合酶Bcchs V基因敲除用质粒的构建
• 5.2.4 质粒转化农杆菌以及农杆菌介导的灰霉转化
• 5.2.5 转化子的分子鉴定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 灰霉基因组的提取
• 5.3.2 几丁质合酶chs V基因上、下游同源序列的扩增
• 5.3.3 含chs V基因敲除构件的质粒构建及亚克隆
• 5.3.4 农杆菌介导的灰霉转化
• 5.4 展望
• 参考文献:
• 致谢
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