烟草突变体创制及其表型鉴定

论文摘要

创制突变体是作物功能基因克隆和品种选育的重要途径。本研究针对烟草红花大金元和珊西两个品种为实验材料,通过农杆菌介导T-DNA插入和辐射诱变方法进行了烟草突变体创制和表型鉴定。获得如下主要结果：1、转基因体系的优化：农杆菌介导用含有抗潮霉素的Hpt基因的二元载体pCMI8将干扰RNA表达基因M8导入烟草叶片外植体中,然后在含有潮霉素的筛选培养基上进行筛选培养。对获得的转基因植株进行PCR检测鉴定,借以初步探讨干扰RNA表达基因M8在植物中的转化和表达情况,结果表明,干扰RNA表达基因M8已整合到烟草的基因组中。在遗传转化过程中,对受体再生系统建立进行了研究,筛选出有利于受体材料的高效培养基配方,最终确定出有利于叶片愈伤诱导的培养基为：MS+6-BAlmg/L+ NAA0.1mg/L;有利于芽分化的培养基为：MS+NAA0.2mg/L.随后通过外植体材料生长状态、Hpt敏感性、预培养时间、农杆菌浓度、浸染时间、共培养时间等对转化的影响研究,建立和优化了转化体系。总体来讲,在附加3%蔗糖的MS培养基上生长的组培苗叶片为最佳外植体,在摇菌过程中,使用50mg/L Kan进行阳性菌株的筛选以及50mg/LRif进行抑菌比较适合,在愈伤组织诱导发生到转化苗出芽生根培养过程中,使用25mg/L Hpt进行阳性植株筛选以及250 mg/LCarb进行抑菌比较适合。25℃黑暗条件下预培养2天,抗性愈伤诱导效果最好；农杆菌浓度在OD600为0.4-0.6,侵染时间为8-10min时,抗性愈伤生长状态最好。2、T-DNA插入突变体：获得转基因植株9株,表型较野生型有显著的变异。株型十分紧凑,节间变窄,茎秆粗壮变短。叶肉细胞增多,叶片变厚,颜色深绿,枝叶茂盛。在花期之前会分化长出2-3个顶芽,在没打顶的情况下会自然长出很多侧芽。3、辐射诱变突变体：用剂量为400Gy60Coγ射线辐照处理烟草红花大金元种子,将处理后的种子种于大田,鉴定后代植株性状的变异。试验研究结果表明：M0代在种子出苗率、植株叶片性状（叶色、叶形、叶面及叶缘等变异）、茎秆性状（株高、株型及侧芽数目变异）、生育期以及花器官等均出现明显变异。本研究为烟草基因遗传分析、基因定位与克隆及其进一步基因功能分析奠定了基础,为烟草育种提供了重要的材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 本文缩写词表
• 第1章 文献综述
• 1.1 烟草
• 1.1.1 烟草属的特征和分类
• 1.1.2 研究烟草的目的和意义
• 1.2 植物转基因
• 1.2.1 植物组织培养原理和方法
• 1.2.2 植物转基因研究进展及安全性争论
• 1.2.3 植物转基因研究的方法
• 1.3 农杆菌介导的植物转基因研究
• 1.3.1 农杆菌的种类和生物学特征
• 1.3.2 根癌农杆菌Ti质粒的基因位点及其功能区域
• 1.3.3 选标记基因和报告基因
• 1.3.4 源基因在转基因后代中的整合、表达和遗传
• 60Co物理诱变'>1.4⁶⁰Co物理诱变
• 1.4.1 诱变的种类和特征
• 60Co物理诱变及其在作物育种上的应用'>1.4.2⁶⁰Co物理诱变及其在作物育种上的应用
• 1.4.3 突变体的鉴定与筛选
• 第2章 烟草T-DNA插入创制突变体
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 烟草组培苗的培育
• 2.2.2 农杆菌感受态的制备
• 2.2.3 质粒向感受态农杆菌的转化（冻融法）
• 2.2.4 叶盘法转化烟草
• 2.2.5 分子水平检测
• 2.2.6 转基因植株的移栽
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 PCR检测结果
• 2.3.2 转基因植株的突变特征
• 2.3.3 农杆菌活化程度及菌液稀释浓度对转化效率的影响
• 2.3.4 农杆菌俊染时间及清洗处理对转化效率的影响
• 2.3.5 共培养时间对转化效率的影响
• 2.4 讨论
• 2.4.1 产生突变的原因
• 2.4.2 烟草遗传转化过程中存在的问题
• 2.4.3 外界环境对转基因遗传特性的影响
• 2.4.4 烟草转基因尚待解决的问题
• 60Co物理诱变创制突变体'>第3章 烟草⁶⁰Co物理诱变创制突变体
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 育苗移栽及变异株的形态观察
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 诱变种子的出苗率
• 3.2.2 叶性状突变体
• 3.2.3 茎秆性状突变
• 3.2.4 育性及成熟期突变
• 3.3 结论
• 第4章 本研究尚待开展的研究内容
• 4.1 转化植株的功能验证
• 1代及后续世代的筛选'>4.2 M₁代及后续世代的筛选
• 参考文献
• 致谢
• 附件