论文摘要
试验目的：以延边黄牛为研究对象，探求—种操作简便、低损伤、去核准确的去核方法，同时确立一种适合延边黄牛体细胞克隆的卵母细胞注核方法，从而为体细胞克隆整体效率的提高打下基础。试验方法：通过两种不同的卵母细胞去核方法的去核比较，试验结果以操作时间效率、卵裂率和发育率来评定，从而验证挤压法的可靠性和可行性。同时对使用此去核方法的去核最佳时间、最佳去除细胞质数量以及确立最佳的注核方法进行研究。试验结果：1．在两种不同去核方法的比较试验中，将Willadsen去核法进行了改进——挤压法，无论在去核操作时间上（41 s／枚），还是在去核效率（80.70％）上都显著地优于盲吸法（76s／枚、65.00％，P＜0.05）；此外，使用盲吸法去核的卵母细胞卵裂率为44.15％，而挤压法（改进的Willadsen法）的卵裂率为51.40％，两者之间差异不显著（P＞0.05），从而创立出一种较适合延边黄牛体细胞克隆的去核方法——挤压法。2．为了进一步确定挤压法的最佳去核时间，通过Hoechst33342染色、荧光显微镜的观察，试验结果显示，延边黄牛卵母细胞随体外成熟培养时间的延长，核与极体之间距离有变大的趋势。这就使以极体为标志去核率随成熟培养时间的延长而下降。本试验确定出适合挤压法的最佳去核时间为20～22h。3．在确定去除细胞质数量的试验中，去除细胞质数量为1／3和1／4（82.54％和81.05％）时的去核率显著高于去除1／5组（64.75％），试验结果看出随着去除细胞质数量的增多，去核率有增高的趋势，但对重组胚的后期发育不利，由表8可以确定去除最佳数量的细胞质为总量的1／4～1／3；而在卵母细胞去除不同的细胞质数量对重组胚卵裂率、发育率的影响试验中，实验结果显示，与另两组相比，去除1／4细胞质组的卵裂率、4-Cell发育率是最高的，分别为41.68％、70.32％（P＜0.05）。综合以上试验结果，从而确立去除1／4总量的细胞质是最佳的。4．在研究卵母细胞注核方法试验中，电融合法注核与细胞浆内注射法相比，在注核显微操作时间效率、卵裂率、4-Cell发育率上，电融合法组分别为53s／枚，43.65％，56.39％（P＜0.05），与细胞浆内注射法组（77s／枚，18.69％，17.50％）之间存在显著差异（P＜0.05），从而确定电融合法是一种适合延边黄牛体细胞克隆的有效注核方法。5．在试验六中，由试验结果显示注核操作液中添加0.1％PVA对核移植卵裂率、发育率与对照组相比（49.34％，63.16％和52.14％，61.67％）（P＞0.05）无显著影响。表明注核操作液中添加PVA并没有起到提高延边黄牛的核移植效果作用。试验结论：在延边黄牛体细胞克隆卵母细胞显微操作方法研究试验中，挤压法是一种操作的快速、简单、实用的去核方法；同时，带下注射法（电融合法）是一种适合延边黄牛体细胞克隆的有效的注核方法。