论文摘要
目的：PTH是体内调节钙平衡和骨代谢的重要激素，近年来大量的动物和临床研究显示PTH间歇性刺激具有促进骨形成的作用，但其作用机制尚不完全清楚。本研究通过蛋白质组学方法研究PTH间歇性刺激对体外培养的大鼠成骨细胞（ROB）分泌蛋白谱的影响，试图沿着PTH对成骨细胞作用途径寻找新的骨代谢调节因子，为进一步研究PTH促成骨作用机制和研制新的促成骨药物打下基础。方法：采用酶消化法原代培养大鼠成骨细胞，在传代后24小时，将培养的细胞分为PTH刺激组（Itm）和对照组（Ctr），刺激组用50ng／mlPTH（1-34）间歇刺激3个周期，即在每个周期24h中，仅在前6h用含50ng／ml PTH（1-34）的DMEM培养液孵育细胞。第三周期采用无血清培养液培养后分别收集6h末和24h末两组细胞的培养液。用透析法-丙酮沉淀法富集培养液中的蛋白质，制备双向电泳（2-DE）样品，进行2-DE实验。通过2-DE图象分析软件比对两组细胞分泌蛋白的2-DE图谱，寻找差异蛋白，再通过基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行质谱分析，得到蛋白的肽质量指纹图谱（PMF），然后用Mascot软件查询Swiss-Prot数据库，鉴定蛋白的种类和性质。结果：我们获得了质量较高的成骨细胞分泌蛋白的双向电泳图谱。经过ImageMaster 2D 5.5软件比对发现，6h末PTH刺激组（Itm6h）较对照组（Ctr6h）有34个差异表达蛋白，24h末刺激组（Itm24h）较对照组（Ctr24h）有35个差异表达蛋白。我们分别选取了Itm6h组的8个差异表达蛋白（4个表达上调，4个表达下调），Itm24h组的15个差异表达蛋白（11个表达上调，4个表达下调）进行质谱分析，鉴定结果显示Itm6h组表达上调的4种蛋白分别为Ubiquitin specific protease 14，Chloride intracellularchannel protein 4，Vimentin，Eukaryotic translation initiation factor 5A-1，4个表达下调的蛋白质分别是：Neurokinin-B precursor，Alpha-2 antiplasmin（Serine（Or cysteine）peptidase inhibitor，clade F，member 1），Heat shock cognate 71 kDa protein，C1r protein。Itm24h组表达上调的11个蛋白分别是：Vimentin，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Rho GDP dissociation inhibitor（GDI）alpha，FK506-binding protein 1A，Pyruvate kinase isozymes M1／M2，Inositol monophosphatase，（IMPase），IGFBP-2，Proteasome subunit alpha type 3，Superoxide dismutase[Cu-Zn]，表达下调的4个蛋白分别是：Glutathione peroxidase 1（GSHPx-1），Metalloproteinase inhibitor 2 precursor（TIMP-2），Transgelin，Alpha-2 antiplasmin（Serine（Or cysteine）peptidase inhibitor，clade F，member 1）。这些差异蛋白按功能分类主要属于细胞骨架蛋白、翻译调控相关蛋白、蛋白降解相关蛋白、信号转导相关蛋白、热休克蛋白／分子伴侣、抗氧化酶及与糖、脂代谢相关的蛋白。结论：通过蛋白质组学研究方法，我们发现在PTH间歇刺激下大鼠成骨细胞的分泌蛋白谱中有多种蛋白表达发生改变，其中有些蛋白是首次发现的成骨细胞分泌蛋白，为进一步研究PTH促成骨机理提供了可靠的依据。