论文摘要
质粒的制备是分子生物学最基本的操作之一。随着DNA疫苗和基因重组药物研究和应用的快速发展,质粒的需求量不断地增加,常规的质粒制备方法已经不能满足当前的需要。在DNA疫苗方面,由于给动物的免疫剂量不足,其效果不明显,与传统的疫苗相比,优势体现不出来,限制了其应用。本文描述了一种获取质粒的新方法,在碱裂解方法的基础上应用过滤的方法除去蛋白质和大的基因组DNA,首先用干酪包布过滤裂解液,异丙醇沉淀,然后再用孔径为0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜过滤滤液,并用70%的乙醇溶液进行冲洗滤膜,自然风干,然后用双蒸水把质粒DNA从滤膜上洗脱下来。该方法不仅适用于质粒DNA的小量抽提,而且适用于500 mL菌液的抽提,产量为15 mg/L,得到质粒DNA的OD260/280平均为1.89。并且该方法操作简单,操作过程中未用有毒有害的物质,而且产量高,纯度好,不仅可用于酶切、连接和转化等分子生物学实验,还可以满足核酸疫苗生产的需要。猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2, PCV2）是引起猪断奶后多系统衰竭综合征及其它相关疾病的病原。本研究将表达猪圆环病毒2型ORF2基因的一套真核表达元件系统克隆插入到质粒载体pMD-18T,构建成pMD-T-ORF2,转化入E.coli DH5α,用本试验室建立的方法提取质粒,经肌肉注射途径对Balb/c小鼠分别在第1 d、第14 d和第28 d进行免疫,用生理盐水作对照,每周采血,对其抗体变化进行监测,在第56 d采取小鼠的脾淋巴细胞,用淋巴细胞转化试验,NK细胞杀伤活性试验,和对脾淋巴细胞中各细胞亚群的变化来观察分析pMD-T-ORF2对Balb/c小鼠的细胞免疫的效果。结果表明,小鼠血清中特异性抗体水平略有上升,在第14 d达到峰值,但是虽然经两次加强免疫抗体水平并没有显著变化,从第56 d特异性抗体水平开始出现下降趋势;脾淋巴细胞体外增值能力实验组比对照组低,而且差异显著（P<0.01）;免疫pMD-T-ORF2的小鼠脾脏NK细胞杀伤活性明显比生理盐水对照组高,自然杀伤率分别为56.01%±4.18%和29.35%±1.42%（P<0.01）;通过流式细胞术对小鼠脾淋巴细胞分析,发现试验组小鼠脾脏中Th细胞的百分含量与生理盐水组小鼠相比无显著差异,但是Tc细胞的百分含量比生理盐水组的高许多（P<0.05）。关于B细胞,试验组比对照组有所减小,但是差异不显著（P>0.05）。