棉花Ca2+转运相关基因的克隆与功能鉴定

2020-12-12阅读(976)

论文摘要

植物细胞膜Ca2+主动运输体系主要包括CAX与Ca2+-ATPase两大类,它们负责将植物细胞内多余的Ca2+转到液泡或者运出胞外,以维持胞内Ca2+的动态平衡。研究表明,CAX与Ca2+-ATPase在植物对冷、盐胁迫及离子毒害等逆境的抗性反应中起着正向或负向调控作用。有关CAX的调控机制目前尚不清楚,但有研究报道它可与一些调控蛋白,如CXIP类蛋白,结合并被激活。利用RACE技术从棉花品系“YZ-1”中克隆出GhCAX1、GhCAX3和GhCXIP2等参与Ca2+转运的基因。构建了GhCAX1、GhCAX3、GhCXIP2和GMCA2等基因的RNAi干涉载体并转化“YZ-1”。另外构建了这些基因的超量表达载体并分别转化“YZ-1”、酵母或烟草,并对转基因酵母和转基因烟草进行了分子鉴定和逆境胁迫处理。取得的主要研究结果如下：1.首次在棉花中克隆出了GhCAX1、GhCAX3和GhCXIP2这3个基因。用生物信息学软件对GhCAX1和GhCAX3进行了蛋白二级结构和氨基酸序列比对分析。发现GhCAX1、GhCAX3均具有属于跨膜蛋白的典型跨膜结构域。它们的N端可能含有一段自我抑制结构域。将GhCAX1、GhCAX3和其N端自我抑制域缺失基因（sGhCAX1、sGhCAX3）分别转化Ca2+敏感酵母突变体菌株‘K667’。鉴定发现只有转N端自我抑制域缺失基因的酵母能在含高浓度Ca2+的YPD培养基上生长,证明GhCAX1、GhCAX13的N端均具有自我抑制结构域,通常条件下并不具备Ca2+转运活性。2.研究意外发现HA标签表达的多肽与GhCAX3在酵母菌株‘k667’中共表达后能恢复菌株的Ca2+转运能力,表明HA多肽可能通过与GhCAX3的N端结构域互作而激活GhCAX3转运Ca2+转的功能。3.对全长或截短形式的GhCAX1和GhCAX3基因重组‘K667’进行250mMLiCl和冷胁迫处理,发现sGhCAXl和sGhCAX3转基因酵母分别对LiCl,冷胁迫的抗性增强,而GhCAX3重组酵母对两种胁迫的抗性均有所增强。我们初步推测GhCAX1和GhCAX3可能具有Li+转运功能,另外,GhCAX3还参与了冷胁迫诱导的Ca2+信号转导。对转GhCAX1, GhCAX3或sGhCAX1, sGhCAX3的T1代烟草幼苗进行150mM NaCl胁迫处理,发现转基因烟草对盐胁迫的抗性均有所增强,初步推断GhCAX1和GhCAX3在烟草中可能也具有转运Na+的功能或参与盐胁迫信号转导。4.对GhCAX1和GhCAX3在烟草中异源表达后具有Ca2+转运活性,并引起植株叶片卷曲,芽心发黄等形态异常的可能原因进行了探讨。5.共获得约85株不同基因的RNAi及超表达的T0代棉花单株,其中11个获得了T,代转基因家系。综合以上结果,GhCAX1和GhCAX3的N端含有自我抑制结构域,其蛋白在酵母中不能被激活。HA标签对GhCAX3的Ca2+转运活性有激活作用。GhCAX1和GhCAX3的异源表达可以提高酵母或烟草对盐和冷胁迫的抗性,后续实验可从离子毒害和逆境诱导的Ca2+信号转导两方面对其抗逆机制进行深入分析。

论文目录

摘要

ABSTRACT

縮写名词表

1 前言

2+转运相关基因的研究进展'>1.1 植物细胞内的Ca²⁺转运相关基因的研究进展

2+内流系统：Ca²⁺通道'>1.1.1 胞质Ca²⁺内流系统：Ca²⁺通道

2+通道'>1.1.1.1 细胞质膜上的Ca²⁺通道

2+通道'>1.1.1.2 内膜系统上的Ca²⁺通道

2+外流系统：Ca²⁺/H⁺反向转运载体(Ca²⁺/H⁺antiporter)和Ca²⁺泵(Ca²⁺-ATPase'>1.1.2 胞质Ca²⁺外流系统：Ca²⁺/H⁺反向转运载体(Ca²⁺/H⁺antiporter)和Ca²⁺泵(Ca²⁺-ATPase

2+泵'>1.1.2.1 Ca²⁺泵

2+/H⁺反向转运载体'>1.1.2.2 Ca²⁺/H⁺反向转运载体

1.2 立题的目的和意义

2+转运相关基因的克隆及表达分析'>2 棉花Ca²⁺转运相关基因的克隆及表达分析

2.1 实验材料

2.1.1 棉花材料

2.1.2 实验主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 棉花材料“YZ-1”幼苗的非生物逆境胁迫处理

2+转运相关基因的克隆'>2.2.2 Ca²⁺转运相关基因的克隆

2.2.2.1 异硫氰酸胍法提取植物组织RNA

2.2.2.2 植物组织RNA浓度及纯度的测定

2.2.2.3 快速扩增cDNA 5’末端（5’-RACE）

2.2.2.4 快速扩增cDNA 3’末端（3’-RACE）

2.2.2.5 基因全长扩增

2+转运相关基因的表达变化'>2.2.3 逆境胁迫下Ca²⁺转运相关基因的表达变化

2.2.4 引物序列

2.3 结果

2+转运相关基因受逆境诱导表达芯片结果分析'>2.3.1 拟南芥Ca²⁺转运相关基因受逆境诱导表达芯片结果分析

2.3.2 棉花GhCAX1,GhCAX3,GhCXIP2和GhACA2基因在逆境胁迫下的表达分析

2.3.2.1 GhCAX1,GhCAX3,GhCXIP2和GhACA2在NaCl处理下的表达分析

2.3.2.2 GhCAX1,GhCAX3,GhCXIP2和GhACA2对低温处理的表达变化

2.3.2.3 PEG处理对GhCAX1,GhCAX3,GhCXIP2和GhACA2基因表达的影响

2.3.3 GhCAX1,GhCAX3和GhCXIP2基因克隆及分析

2.3.3.1 GhCAX1,GhCAX3和GhCXIP2基因全长的扩增

2.3.3.2 GhCXIP2氨基酸序列分析

2.3.3.3 GhCAX1,GhCAX3与GhCXIP2二级结构预测

2.3.3.4 GhCAX1和GhCAX3的蛋白分类及N端结构域分析

2.3.4 GhCAX1,GhCAX3,GhCXIP2和GhACA2在棉花中的组织表达分析

2.4 分析讨论

2.4.1 GhCAX1,GhCAX3与GhCXIP2的结构与功能分析

2.4.2 GhCAX1,GhCAX3,GhCXIP2和GhACA2的组织表达与逆境诱导表达分析

3 重组酵母的鉴定与分析

3.1 实验材料

3.1.1 菌株、载体及培养基

3.1.2 实验试剂

3.1.3 引物合成

3.2 实验方法

3.2.1 酵母表达载体piHGPD-（s）GhCAX1,（s）GhCAX3及pYX212-GhCAX1,GhCXIP2的构建

3.2.2 重组质粒的酵母转化及分子检测

3.2.2.1 酵母转化

3.2.2.2 重组酵母的PCR检测

3.2.2.3 重组酵母Northern检测

2+耐受性分析'>3.2.3 重组酵母Ca²⁺耐受性分析

2+活性的影响'>3.2.4 GhCXIP2,GhCAX3与GhCAX1共表达对其转运Ca²⁺活性的影响

3.2.5 重组酵母突变体K667逆境胁迫处理

3.3 结果

3.3.1 酵母重组表达载体的双酶切鉴定

3.3.2 重组酵母的分子检测

2+的功能'>3.3.3 GhCAX1和GhCAX3转运Ca²⁺的功能

2+活性影响'>3.3.4 GhCXIP2,GhCAX3与GhCAX1共表达对载体转运Ca²⁺活性影响

3.3.5 重组酵母的抗逆性检测

3.4 分析与讨论

2+的功能分析'>3.4.1 GhCAX1,GhCAX3转运Ca²⁺的功能分析

3.4.2 GhCAX1,GhCAX3抗逆功能分析

3.4.3 下一步工作建议

2+转运相关基因在烟草和棉花中的遗传转化与鉴定'>4 CA²⁺转运相关基因在烟草和棉花中的遗传转化与鉴定

4.1 实验材料

4.1.1 植物材料,菌株和载体

4.1.2 培养基

4.1.3 实验试剂

4.1.4 引物合成

4.2 实验方法

4.2.1 植物载体构建

4.2.1.1 GhCAX1,GhCAX3,GhCXIP2,GhACA2 RNAi抑制表达载体的构建

4.2.1.2 超量表达载体pGWB417-GhCAX1,GhCAX3和pGWB418-sGhCAX1,sGhCAX3以及pK2GW7-GhCXIP2的构建

4.2.2 电击转化农杆菌感受态EHA及分子检测

4.2.2.1 农杆菌的转化

4.2.2.2 农杆菌重组质粒的PCR检测

4.2.3 外植体的遗传转化与鉴定

4.2.3.1 陆地棉“YZ-1”的遗传转化

4.2.3.2 烟草的遗传转化

4.2.3.3 转基因烟草植株的获得

4.2.3.4 转基因烟草耐性分析

4.3 结果

4.3.1 植物RNAi和表达载体的构建及鉴定

4.3.1.1 RNAi载体的双酶切鉴定

4.3.1.2 重组超表达载体的验证

4.3.1.3 RNAi及超表达载体转化根癌农杆菌EHA

4.3.2 陆地棉“YZ-1”的遗传转化

4.3.3 转基因棉花的获得

4.3.4 烟草的遗传转化

0代烟草阳性检测'>4.3.5 转基因T₀代烟草阳性检测

1代单拷贝筛选及表达量鉴定'>4.3.6 T₁代单拷贝筛选及表达量鉴定

1代转基因烟草植株表型的变化'>4.3.7 T₁代转基因烟草植株表型的变化

4.3.8 转基因烟草的初步耐性分析

1代转基因烟草在不含Ca²⁺的MS培养基上的生长状况'>4.3.8.1 T₁代转基因烟草在不含Ca²⁺的MS培养基上的生长状况

4.3.8.2 T1代转基因烟草在含NaCl的MS培养基上的生长状况

4.4 分析讨论

4.4.1 烟草外源基因拷贝数的鉴定

4.4.2 利用烟草作功能辅助分析

4.4.2.1 GhCAX1和GhCAX3的表达影响转基因烟草植株的表型

4.4.2.2 转基因烟草耐盐性提高

4.4.3 下一步工作建议

参考文献

致谢

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标签：酵母论文; 烟草论文; 陆地棉论文; 端自我抑制结构域论文; 耐盐论文; 冷胁迫抗性论文;

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