论文摘要
背景和目的CD4+CD25+调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg cell）是近年来逐渐被人们认识的一类具有免疫调节功能的T细胞亚群，在维持机体免疫耐受、移植免疫和肿瘤免疫逃逸等方面发挥着重要作用。研究发现在成人外周血中仅CD4+CD25highTreg细胞具有抑制功能。近年来的研究证实转录因子Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞发育和发挥免疫抑制功能的关键因子。目前对CD4+CD25+Treg细胞的发生、发育、成熟以及功能的分子机制仍不十分清楚。本研究首先通过检测新生儿脐带血CD4+CD25high调节性T细胞（Treg）数量及胞内转录因子Foxp3的表达，拟探讨Treg细胞在新生儿期的表达特点及与Foxp3的关系。其次通过观察经转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的新生儿脐带血Treg细胞中Foxp3和IL-10表达特点，拟探讨TGF-β1在诱导产生的新生儿脐带血Treg细胞中的作用，从而为新生儿脐带血在免疫调节性疾病中的应用提供理论基础。方法1．采集新生儿脐带血和成人外周血获取单个核细胞后，在流式细胞仪上检测CD4+CD25highTreg细胞的数量及其胞内转录因子Foxp3的表达。2．脐带血单个核细胞用CD3mAb激活后，加IL-2培养扩增，同时加入不同浓度的TGF-β1干预，并以不加TGF-β1作为对照，扩增第4天分别用流式细胞术和RT-PCR技术检测扩增后的CD4+CD25+Treg细胞Foxp3蛋白和Foxp3mRNA的表达。3．脐带血单个核细胞经CFSE染色后，用CD3mAb激活同时加IL-2和5ng／mL TGF-β1扩增，分别于培养的第4、6、8天用流式细胞仪Cellquest软件获取数据，并用ModFit软件分析淋巴细胞各亚群的增殖动力学变化。4．用ELISA法检测CD3mAb激活同时加IL-2和不同浓度TGF-β1扩增后第4天培养上清液中细胞因子IL-10水平。结果1．新鲜脐带血Treg细胞占CD4+T细胞的比例（3．86±1．63％）明显高于成人外周血（0．87±0．74％）（P<0．01）；而脐带血Treg细胞中表达Foxp3的比例明显低于外周血Treg细胞（23．21±8．9％vs 71．3±11．6％，P<0．01）。2．脐带血单个核细胞培养后第4天用流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞Foxp3表达，与对照组（31．64±7．59）％相比，1ng/mL，5ng/mL，10ng/mL的TGF-β1处理组分别为（48．39±13．51％，P>0．05），（61．35±6．79％，P<0．01），（56．34±5．11％，P<0．05）。而在CD4+CD25highT细胞(以CD25荧光强度>102确定为CD25high表达的标准)中Foxp3表达分别是（69．28±3．91）％，（78．20±4．73）％，（69．96±8．48）％，明显高于对照组（47．18±8．13％，P<0．01）。3．RT-PCR检测Foxp3 mRNA的表达发现Foxp3／β-action的净光密度值比在对照组、1ng/mL、5 ng／mL、10 ng/mL TGF-β1组分别是：0．317；0．440；0．727；0．584。以5 ng／mLTGF-β1组Foxp3 mRNA表达量最高。4．流式细胞术Modifit软件分析5ng／mLTGF-β1处理组第4、6、8天CD4+CD25+Treg细胞增殖指数分别为：3．15，11．52，23．04；而CD8+T细胞分别为：2．16，4．23，5．43。第4天CD4+CD25+Treg细胞第5代到第6代所占的比例27．75％，CD8+T细胞仅为4．89％；第6天CD4+CD25+Treg细胞第5代到第8代所占的比例81．49％，CD8+T细胞为44．57％；第8天CD4+CD25+Treg细胞第8代到第10代所占的比例52．74％，CD8+T细胞为13．54％。在同一时间点CD4+CD25+Treg细胞增殖优于CD8+T细胞。5．分别收集1 ng／mL、5 ng/mL、10 ng／mL TGF-β1处理组培养第四天的细胞上清液检测IL-10浓度（pg／mL）分别是（72．00±10．15），（133．63±25．75），（136．14±15．53），明显高于对照组（49．92±10．37，P均<0．01）。结论1．虽然新生儿脐带血CD4+CD25highTreg细胞数量明显高于成人外周血，但其中Foxp3+细胞数量明显低于成年人，提示脐带血CD4+CD25highTreg细胞在功能上可能尚未成熟。2．在体外，TGF-β1能够促进脐带血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的增殖，且诱导Treg细胞分泌IL-10增加。
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