论文摘要
造血细胞生长因子是细胞因子中的一个重要组成部分,在血细胞生成调节机制中具有重要意义。人粒细胞集落刺激因子（hG-CSF）是一种定向作用于粒系祖细胞的造血生长因子。1991年美国FDA最早批准重组人G-CSF上市,目前我国已批准18家制药企业生产rhG-CSF,批准文号为69个。本文就rhG-CSF的基因合成、克隆、原核表达、生物活性开展工作,通过密码子的全面优化,提高表达量,进一步降低rhG-CSF的生产成本。根据文献报道,成熟hG-CSF含有174个氨基酸残基；根据宿主菌的密码子偏爱性,将人源基因按照宿主密码子偏爱性进行全面优化,并在基因5’上游添加限制性内切酶位点、起始密码子、His-Tag、蛋白酶位点,在基因3’下游添加终止子密码、限制性内切酶位点,拟合成序列全长为597bp,再利用GeneDesign 3.0将拟合成的序列拆分为16条单链寡核苷酸,化学合成后应用两步法进行序列拼接成全长序列。同时利用RT-PCR技术钓取人源G-CSF基因,与化学合成基因按照同样方法克隆到pET23a中,构建表达载体pET-sCSF。将二者转化到含有增强表达效果的E.coli BL21（DE3）宿主中,分别构建成E.coli sCSF、和E.coli hCSF表达菌株。进一步考察IPTG诱导起始时间、诱导持续时间、诱导浓度、培养温度对G-CSF表达量及其在细胞总蛋白所占比重的影响。外源基因表达的最适条件为,接种后37℃培养6h,加入终浓度为40μmol/ml的IPTG,继续诱导培养6h,收获菌体,超声破碎后进行相关检测。合成基因将人源基因中编码Leu的2个CTA、编码Pro的10个CCC、编码Cys的1个TGT、编码Arg的1个AGG的密码子用大肠杆菌细胞内丰沛的密码子CTG、CCG、TGC、CGT替代,外源蛋白的表达量增加21.9%,在菌体中所占比例增加17.2%。且表达的目的蛋白主要以可溶形式存在（90.9%）,占上清液总蛋白含量的35.2%。
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标签：粒细胞集落刺激因子论文; 基因合成论文; 密码子优化论文; 表达量增加论文;