论文摘要
研究背景目前临床急需一种起效快、效果好、副作用小且能维持手术时间的新型皮肤局麻药物制剂,用以满足皮肤穿刺性检查、皮肤外科手术以及激光美容等各种医疗手段所引起的皮肤浅表创伤性疼痛的镇痛需要。目前已有的经皮局麻药物制剂如EMLA乳膏、或者其它局麻药物的相关制剂,如酊剂、凝胶和霜剂等由于副作用明显或经皮渗透效果不理想等原因而达不到安全、有效的局麻目的。影响药物经皮速率的主要是皮肤角质层屏障,而目前增加药物皮肤渗透性的主要方法包括采用物理或化学的方法,但是以上方法均存在一定的局限性和不足之处,如加入化学促渗剂易干扰皮肤细胞的结构,而某些新型物理经皮装置或方式,如微针等则存在高成本及难以避免的皮肤伤害性。因此,新经皮剂型载体的研发在经皮给药系统（Transdermal drug delivery systems, TDDS）研究中依旧占据着极其重要的地位,它将对局麻药物迅速进入皮肤起决定性的作用。醇质体是一种新型的囊泡结构并含有一定比例醇的脂质体,由磷脂、胆固醇、醇及水组成。醇质体具有热力学稳定、粒径小、包封率高、透皮性能强、皮肤耐受性能好等特点,因此,用它作为局麻药物的载体,在使用安全的前提下,以便有效增强药物的经皮渗透性,从而起到安全、迅速起效的作用效果。本研究拟选择具有起效快,药效好,弥散性广,安全性好,无明显血管扩张等特点的酰胺类局麻药一利多卡因制备利多卡因醇质体经皮局麻制剂,并对其形态、粒径、包封率、稳定性等理化性质,以及经皮渗透性、安全性和药效学等方面展开全面的分析和评价。目的确定制备利多卡因醇质体的组方；分析及评价利多卡因醇质体微粒的形态、粒径大小、包封率、稳定性、经皮渗透性及其影响因素、使用安全性和药效学。研究成果将为临床提供一种安全性好、局麻迅速且能维持一定手术时间的新型经皮局麻药物制剂。方法1、采用正交实验设计L9（34）表制定5%利多卡因醇质体的组方以无水乙醇、蛋黄卵磷脂、胆固醇的质量百分数为考察因素,以包封率为衡量指标确定5%利多卡因醇质体最佳处方；2、5%利多卡因醇质体、脂质体的制备①采用注射超声过滤法制备5%利多卡因醇质体：称取处方量的无水乙醇、蛋黄卵磷脂、胆固醇、利多卡因、超纯水,依次加入10mL的离心管中,置于涡旋混匀器上混匀至完全溶解后于超声粉碎仪下超声（冰水浴条件下）,超声处理功率为105w,时间为2min,超声处理后用0.22μm针头式过滤器过滤即得5%利多卡因醇质体；②采用薄膜扩散法制备5%利多卡因脂质体：称取处方量的蛋黄卵磷脂、胆固醇、利多卡因,加入装有6mL无水乙醇的梨形瓶中,然后将梨形瓶接到真空旋转蒸发仪上,直至梨形瓶中有一层脂质薄膜层形成,取下梨形瓶,加入超纯水充分水和,再按照醇质体制备方法超声处理后即得5%利多卡因脂质体；3、联用透析袋平衡透析法及高效液相色谱法测定各组方醇质体的载药率及包封率①载药率：将50μL待测样品于10mL容量瓶中甲醇定容,混匀,超声处理10min,行高效液相色谱检测,以分析样品载药率；②包封率：将透析袋剪成约10cm长小段,于沸水中煮沸10min后将透析袋清洗干净,将透析袋一端封闭并检查透析袋是否渗漏,加入2mL待测样品后封闭另一端,将透析体系置于无水乙醇含量为2%的250mL醇水溶液中,置于磁力搅拌器上持续搅拌（60rpm,25℃）,平衡9h后取透析袋外液行HPLC测定游离利多卡因的含量。同时行空白醇质体对照,以排除辅料的干扰；4、采用透射电镜观察最佳处方醇质体的形态先吸取1滴5%利多卡因醇质体滴于铜网上,2min后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体；再滴加1滴磷钨酸（3%,pH7.0）于铜网,2min后用滤纸从铜网边缘吸去多余染液；然后滴加1滴超纯水于铜网,用滤纸从铜网边缘吸取多余水,自然晾干后,120KV加速电压下利用透射电镜下观察5%利多卡因醇质体的形态；5、采用马尔文粒径仪测量5%利多卡因醇质体的粒径将2mL的5%利多卡因醇质体倒入测试杯中,无需进一步浓缩或稀释处理,以90°角光电倍增管测定其粒径；6、采用Franz扩散池比较测定5%利多卡因醇质体、脂质体及醇水溶液的体外透皮性能,比较分析醇质体组方构成对醇质体经皮渗透的影响取雄性SD大鼠（250300g）,苯巴比妥钠腹腔注射麻醉,电动剃刀剃去腹部鼠毛,取下已去毛的鼠皮并小心分离皮下组织与脂肪,用生理盐水反复冲洗,滤纸吸干即刻使用,大鼠腹部皮肤的角质层面朝向供给池。扩散池有效渗透面积为2.92cm2,接收池容积为7mL,接收液为乙醇浓度为5%的醇水溶液。电磁搅拌器转速为300rpm,温度为：37±1℃,并分别于0.5,1,2,3,6,9,11h取出接受液0.4mL后高速离心10min后取上清液行高效液相色谱检测,样品取出后以及加入等体积的新鲜接收液。加入接收池的5%利多卡因醇质体、脂质体、醇水溶液以及空白醇质体、脂质体、醇水溶液均为1.5mL;7、通过温度和时间的变化来考察5%利多卡因醇质体的稳定性分别将5%利多卡因醇质体存放于4±1℃,25±1℃及37±1℃条件下60天后,采用高效液相色谱（HPLC）分析测定5%利多卡因醇质体的包封率来评价利多卡因醇质体微粒的稳定性；8、采用豚鼠背部皮肤局部浸润法比较测定5%利多卡因醇质体、脂质体及醇水溶液的局麻药效将豚鼠背部毛发剃净,将5%利多卡因醇质体、脂质体及和醇水溶液涂布在无毛皮肤上,在预定时间（给药后的10,15,20,25,30,40,50,60,80,100,120min）用针刺法刺激给药部位周边6mm带状区域的皮肤,观察皮肤的负反应数；同法,将上述3种药物作用于豚鼠背部皮肤1小时后将药物拭去,并于去除药物后的10,20,40,60,80,100,120rain时分别采用针刺法测定给药豚鼠的负反应数；9、5%利多卡因醇质体作用于豚鼠背部皮肤后,通过肉眼评测法及组织病理学检测法对制剂的使用安全性进行有效评估白色雄性豚鼠（250—300g）的背部毛发用电动剃刀剃净后,将背部的皮肤分成完整皮肤和破损皮肤两组,利用磨砂纸垂直、水平磨擦豚鼠背部皮肤以形成破损皮肤。将5%利多卡因醇质体作用于豚鼠背部完整皮肤和破损皮肤,观察作用部位红斑、水肿表现并按评测标准进行评分,并通过组织病理学观察和评测利多卡因醇质体的安全性。红斑计分标准为：无红斑计0分,轻度红斑计1分,明显红斑计2分,中度至重度红斑计3分,深度红斑并紫痂计4分；水肿计分标准为：无水肿计0分,轻度水肿计1分,轻度水肿（可见水肿轮廓）计2分,中度水肿计3分,重度水肿计4分；组织病理学考察指标包括：角质层结构的变化,真皮层有无明显的中性粒细胞浸润、血管扩张充血、血管周围炎性细胞浸润、血管炎、真皮水肿或出现成纤维细胞增生和纤维化等真皮组织炎症性病理改变；10、统计学处理①采用SPSS 13.0对数据进行统计学分析;②多组样本均数之间的比较：当满足方差齐性时,使用单向方差分析和样本均数间的多重比较（LSD法）；当不满足方差齐性时使用近似F检验（Welch检验方法）及校正的多重比较方法（Dunnett’s T3）;③正交实验设计使用正交设计助手ⅡV3.1进行分析；④对重复测量数据进行重复测量方差分析；⑤使用Graphpad Prism 5.0绘制曲线；⑥以P<0.05视为有统计学意义,结果中数据以x±SD表示。结果1、根据正交试验设计结果,确定5%利多卡因醇质体的最佳处方为：35%无水乙醇,5%蛋黄卵磷脂,0.2%胆固醇,5%利多卡因,49.8%超纯水（百分数为质量百分数比）；影响利多卡因醇质体包封率的主次因素顺序为：蛋黄卵磷脂浓度>无水乙醇浓度>胆固醇浓度；根据最佳处方制备的利多卡因醇质体的载药率为：（95.0±0.06）%（n=3）,包封率为：（51.44±3.75）%（n=7）。2、利用薄膜扩散法制备的5%利多卡因脂质体的载药率为：（98.85±0.24）%（n=4）；包封率为：（46.20±1.50）%（n=7）。3、HPLC色谱条件为：色谱柱：C8柱（HRC-C8,SHIMADZU,250×4.6mm, 5μm）；流动相：甲醇：乙酸铵溶液（Ph=6.71）=70：30；检测波长：270nm;流速：0.8mL·min-1;柱温：30℃；进样量：10μL。4、透射电镜（TEM）观察5%利多卡因醇质体形态为大小较均一的圆形球体。5、马尔文粒径仪（Malvern）测得5%利多卡因醇质体的粒径大小为：31.33±2.63nm（n=3）,多分散性指数为0.42±0.21（n=3）。6、5%利多卡因醇质体、脂质体、醇水溶液的体外累计透皮吸收量通过重复测量方差分析发现：①重复效应和交互效应的方差分析结果显示：三组制剂之间存在显著性差异（F=110.970,P<0.001）；透皮时间之间存在统计学差异（F=369.059,P<0.001）；制剂和透皮时间之间存在显著的交互效应（F=179.226,P<0.001）②醇质体、脂质体和醇水溶液三组制剂的经皮累积透皮吸收值进行比较,不满足方差齐性（F=71.654,P<0.001）,使用近似Welch方法进行分析,三组制剂间存在显著差异（F=19.001,P<0.001）,各制剂间多重比较使用Dunnett’s T3进行分析,结果显示：醇质体与脂质体之间存在显著性差异（P=0.001）,醇质体与醇水溶液之间存在显著性差异（P<0.001）,脂质体和醇水溶液间存在显著性差异（P=0.004）;③醇质体0.5-11h的累积透皮量Q对时间t回归得线性方程：Q=421.664t-187.120 （R2=0.912, F=340.198, P=0.000）,累计透皮量与时间t线性关系良好,皮肤渗透速率为421.7±22.86μg·cm-2·h-1;④脂质体0.5-11h的累积透皮量Q对时间t回归得线性方程：Q=135.435t-73.837（R2=0.918, F=368.175, P<0.001）,皮肤渗透速率为：135.435±7.058μg·cm-2·h-1;⑤醇水溶液脂质体0.5-11h的累积透皮量Q对时间t回归得线性方程：Q=46.832t-0.750 （R2=0.735, F=91.753, P<0.001）,皮肤渗透速率为：46.832±4.889μg·cm-2·h-1;⑥醇质体的皮肤渗透速率分别是脂质体和醇水溶液的3.113和9.004倍。7、5%利多卡因醇质体、脂质体及醇水溶液作用于豚鼠完整皮肤后,豚鼠皮肤对刺激产生负反应的重复测量分析结果显示：①重复效应和交互效应的方差分析结果显示：三组制剂之间存在显著性差异（F=14.918,P<0.001）；作用时间之间存在统计学差异（F=863.566,P<0.001）；制剂和作用时间之间无显著的交互效应（F=2.401,P=0.101）；②醇质体、脂质体和醇水溶液三组制剂作用于豚鼠皮肤的负反应进行比较,满足方差齐性（F=1.638,P=0.199）,三组制剂间存在显著差异（F=7.696,P=0.001）,各制剂间多重比较使用LSD法进行分析,结果显示：醇质体与脂质体之间存在显著性差异（P=0.004）,醇质体与醇水溶液之间存在显著性差异（P<0.001）,脂质体和醇水溶液间无显著性差异（P=0.443）。对5%利多卡因醇质体、脂质体及醇水溶液这三种药物豚鼠完整皮肤组涂药1h后去除药物,豚鼠对刺激的负反应数（次／只）进行重复测量分析显示：①重复效应和交互效应的方差分析结果显示：三组制剂之间存在显著性差异（F=226.925,P<0.001）；作用时间之间存在统计学差异（F=106.462,P<0.001）；制剂和作用时间之间存在显著的交互效应（F=3.335,P<0.001）；②醇质体、脂质体和醇水溶液三组制剂作用于豚鼠完整皮肤1h后去除药物,豚鼠皮肤对刺激产生负反应进行比较,满足方差齐性（F=1.6382.323,P=0.102）,三组制剂间存在显著差异（F=128.489,P<0.001）,各制剂间多重比较使用LSD法进行分析,结果显示：醇质体与脂质体之间存在显著性差异（P<0.001）,醇质体与醇水溶液之间存在显著性差异（P<0.001）,脂质体和醇水溶液间存在显著性差异（P<0.001）。8、5%利多卡因醇质体的时间和温度稳定性检测通过测定于不同温度下存放60天的5%利多卡因醇质体的包封率来评价：①对利多卡因醇质体的稳定性进行协方差分析,在排除了60天前基础包封率对于醇质体存放60天后的包封率的影响后,不同温度间包封率是有显著性差异的（F=58.190,P<0.001）,而60天前基础包封率对于存放60天后的包封率无统计学意义（F=0.065,P=0.802）；②利多卡因醇质体的不同时间的包封率的比较,不满足方差齐性检验（F=33.496,P<0.001）,使用Welch方法进行分析,不同时间和温度下的包封率存在统计学差异（F=205.640,P<0.001）;③不同时间组的包封率的比较使用Dunnett’s T3进行分析：醇质体在4±1℃存放60天包封率与60天前5%利多卡因包封率比较有显著性差异（P<0.001）,在37±1℃存放60天包封率与60天前5%利多卡因包封率比较有显著性差异（P=0.048）,但是在25±1℃条件下存放60天后的5%利多卡因醇质体包封率较60天前5%利多卡因包封率无统计学差异（P=1.000）。结果显示：存放60天后,在4±1℃条件下,5%利多卡因醇质体的药物泄漏率最大,37±1℃次之,而在25±1℃条件下,泄漏率最小。9、豚鼠背部皮肤给药后的红斑和水肿情况观察显示：无明显红斑和水肿情况出现；组织学检查结果显示：完整皮肤和破损皮肤经利多卡因醇质体处理1h时,皮肤表皮结构基本完整,角质层变薄,破损皮肤的角质层受到一定程度的损害。完整皮肤和破损皮肤经利多卡因醇质体处理24h后,表皮结构仍完整,破损皮肤角质层得到一定程度的恢复。完整皮肤和破损皮肤经利多卡因醇质体处理48h后,表皮结构完整,皮肤角质层恢复程度较前更加明显。完整皮肤和破损皮肤在经利多卡因醇质体处理72h后角质层较正常皮肤无明显变化。完整皮肤和破损皮肤在1h、24h、48h及72h时,皮肤真皮均无明显中性粒细胞浸润、血管扩张充血、血管周围炎性细胞浸润、血管炎、真皮水肿或出现成纤维细胞增生和纤维化等真皮组织炎性病理改变。结论1、5%利多卡因醇质体为大小均一的圆形微粒,分散指数小,包封率较高、于25℃室温保存下为宜；2、体外经皮渗透结果显示：醇质体的经皮渗透性显著高于脂质体和醇水溶液；组方中影响醇质体经皮速率的主要因素为乙醇,以及乙醇、蛋黄卵磷脂和皮肤的协同作用；3、体内局麻药效研究显示：5%利多卡因醇质体较脂质体及醇水溶液有更快的起效时间和更长的维持时间；4、5%利多卡因醇质体安全性评价结果显示其具有良好的经皮使用安全性；5、5%利多卡因醇质体作为新型经皮局麻药物,非常值得进一步展开研究。
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