微生物来源36家族α-半乳糖苷酶的基因克隆与性质研究

论文摘要

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase,α-D-galactoside galactohydrolase; EC 3.2.1.22）也称蜜二糖酶,是一种外切糖苷酶,催化移除不同底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶在医疗、食品、化工及饲料等方面有着广泛的应用。在饲料工业中,α-半乳糖苷酶添加剂是去除豆粕中α-半乳糖苷寡糖类抗营养因子的首选方法。饲用α-半乳糖苷酶的生产目前尚未形成产业化,其中,性质优良的α-半乳糖苷酶的发掘是一个亟待解决的关键问题。本研究通过对菌种新颖性和产酶能力的评估,确定了根霉F78（Rhizopus sp. F78）、赤霉F75（Gibberella sp. F75）、链霉菌（Streptomyces sp.）S9和S27及耶尔森氏菌（Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001）为本实验的研究对象。根霉和赤霉都是重要的工业菌种,但未见这2个属中α-半乳糖苷酶基因克隆与表达的相关报道。链霉菌S9和S27是分离自火焰山的2个菌株,生长条件特殊。利用生物信息学的方法,对微生物来源糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶序列进行比对和分析,总结该家族的酶蛋白在分子量大小上的差异,进行分类、分析和简并引物设计,通过简并PCR扩增得到来源于研究菌株中编码α-半乳糖苷酶的基因片断,再结合不同的基因克隆方法最终获得这些基因的全序列。因此,基于这对保守基序设计的简并引物可以有效的扩增到糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶基因。对5个实验菌株中获得的α-半乳糖苷酶基因进行BLAST比对,分析其编码的氨基酸序列与已报道的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列的相似性。结果表明来源于根霉F78的α-半乳糖苷酶Aga-F78最高相似性为45%,赤霉F75的α-半乳糖苷酶Aga-F75最高相似性为69%,链霉菌S9的α-半乳糖苷酶Aga-S9最高相似性为36%,链霉菌S27的α-半乳糖苷酶Aga-S27最高相似性为55%,耶尔森氏菌的α-半乳糖苷酶Aga-Y最高相似性为57%,而5个酶相互之间的相似性介于25-40%。因此,这5个α-半乳糖苷酶基因均具有很高的新颖性。5个α-半乳糖苷酶基因均在大肠杆菌中异源表达,并验证其基因功能,酶纯化后进行了详细的酶学性质研究。5个α-半乳糖苷酶的性质比较表明,真菌来源的α-半乳糖苷酶最适pH值偏酸性,在4.0-5.0间,而细菌来源的则在7.0-7.5的中性范围内;温度特性上,真菌来源的α-半乳糖苷酶最适温度在50-60℃,细菌来源的在35-40℃,Aga-F75-H、Aga-F78-H、Aga-S27-H热稳定性较好;Aga-F75-H和Aga-F78-H对多种蛋白酶有良好的抗性;Aga-Y-H具有一定适冷酶特性,这在其它α-半乳糖苷酶的研究中还未见报道。因此,获得的这些性质各异的α-半乳糖苷酶,不仅具有在不同领域的实际应用价值,也为研究其结构和功能提供了良好的材料。饲料添加剂中,α-半乳糖苷酶常需要与蛋白酶共同作用,以提高饲料中营养物的利用率。另外,酶蛋白对胃肠道内蛋白酶的抗性,可以延长其作用时间,提高其利用效率。所获得的α-半乳糖苷酶与胰蛋白酶共作用降解豆粕的试验显示,其中4种酶单独作用时都可较大幅度提高半乳糖的含量。Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H与胰蛋白酶共作用不影响α-半乳糖苷酶的降解能力。对于Aga-F75-H,单独作用时使半乳糖的含量增加了82.42倍,添加胰蛋白酶后降解量又进一步增加了约36%。这些酶学性质表明Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H,特别是Aga-F75-H具有很好的饲料工业应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 α-半乳糖苷酶的研究进展
• 1.1 α-半乳糖苷酶的来源
• 1.2 α-半乳糖苷酶的酶学特性
• 1.3 α-半乳糖苷酶的分类
• 1.4 α-半乳糖苷酶的分子特性
• 2 α-半乳糖苷酶的应用
• 2.1 α-半乳糖苷酶与豆粕饲料
• 2.2 α-半乳糖苷酶与食品工业
• 2.3 α-半乳糖苷酶与医疗
• 2.4 α-半乳糖苷酶与其他工业
• 3 α-半乳糖苷酶基因工程的研究
• 4 基因克隆技术的研究进展
• 4.1 构建基因组文库
• 4.2 Tail-PCR技术
• 4.3 3′RACE 和5′RACE （rapid amplificationof cDNA ends）
• 4.4 简并PCR （Degenerate PCR）
• 5 大肠杆菌表达系统的研究进展
• 5.1 表达载体
• 5.2 宿主细胞
• 5.3 大肠杆菌中外源蛋白的高效表达策略
• 6 研究的目的和意义
• 第二章 来源于根霉（Rhizopus sp. F78） α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和酶学性质
• 1. 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 引物合成
• 1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 1.4 仪器
• 1.5 培养基
• 1.6 常用溶液
• 2. 实验方法
• 2.1 根霉F78 产酶能力的验证
• 2.2 根霉F78 菌种鉴定
• 2.3 来源于根霉F78 的α-半乳糖苷酶基因aga-F78 的克隆
• 2.4 原核表达载体 pET-22b（+）lic/aga-F78-H 的构建
• 2.5 重组酶Aga-F78-H与原酶Aga-F78 分离纯化与性质研究
• 3 结果与分析
• 3.1 菌株F78 产酶能力的验证
• 3.2 产α-半乳糖苷酶菌株F78 的鉴定
• 3.3.α-半乳糖苷酶基因 aga-F78 的克隆、表达
• 3.4 重组酶Aga-F78-H与原酶Aga-F78 的纯化及蛋白性质
• 3.5 重组酶Aga-F78-H与原酶Aga-F78 酶学性质研究
• 4 讨论
• 4.1 重组酶Aga-F78-H的克隆、表达
• 4.2 重组酶 Aga-F78-H与原酶 Aga-F78 的性质比较分析
• 本章小结
• 第三章 来源于赤霉（Gibberela sp. F75） α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和酶学性质
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 引物合成
• 1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 1.4 仪器
• 1.5 培养基
• 1.6 常用溶液
• 2 实验方法
• 2.1 赤霉F75 产酶能力的验证
• 2.2 赤霉F75 的菌种鉴定
• 2.3 α-半乳糖苷酶基因aga-F75 的克隆
• 2.4 原核表达载体 pET-22b（+）/aga-F75-H 的构建
• 2.5 重组酶Aga-F75-H的纯化
• 2.6 重组酶Aga-F75-H酶学性质测定
• 2.7 重组酶Aga-F75-H比活性测定
• 2.8 重组酶Aga-F75-H底物特异性的测定
• 2.9 重组酶Aga-F75-H对豆粕降解能力的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 产α-半乳糖苷酶的菌株F75 的分子鉴定
• 3.2 赤霉F75 产酶能力的验证
• 3.3 α-半乳糖苷酶基因aga-F75 的克隆
• 3.4 原核表达载体 pET-22b（+）/aga-F75-H 的构建
• 3.5 重组酶Aga-F75-H的诱导表达与纯化
• 3.6 重组酶Aga-F75-H 酶学性质测定
• 3.7 Aga-F75-H底物特异性的测定
• 3.8 重组酶Aga-F75-H对豆粕降解能力的研究
• 4 讨论
• 本章小节
• 第四章 来源于链霉菌S9 （Streptomyces sp. S9） α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和酶学性质
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 引物合成
• 1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 1.4 仪器
• 1.5 培养基
• 1.6 常用溶液
• 2 实验方法
• 2.1 链霉菌S9 产酶能力的验证
• 2.2 α-半乳糖苷酶基因aga-S9 的克隆
• 2.3 原核表达载体pET-28a（+）/aga-S9-H 的构建
• 2.4 重组酶Aga-S9-H的纯化
• 2.5 重组酶Aga-S9-H 酶学性质测定
• 2.6 重组酶Aga-S9-H比活性测定
• 2.7 重组酶Aga-S9-H底物特异性的测定
• 2.8 重组酶Aga-S9-H对豆粕降解能力的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 链霉菌S9 产酶能力的验证
• 3.2 α-半乳糖苷酶基因aga-S9 的克隆
• 3.3 原核表达载体pET-28a（+）/aga-S9-H的构建
• 3.4 重组酶Aga-S9-H的诱导表达与纯化
• 3.5 重组酶Aga-S9-H 酶学性质测定
• 3.6 重组酶Aga-S9 底物特异性的测定
• 3.7 重组酶Aga-S9-H对豆粕降解能力的研究
• 4 讨论
• 本章小节
• 第五章 来源于链霉菌S27 （Streptomyces sp. S27） α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和酶学性质
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 引物合成
• 1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 1.4 仪器
• 1.5 培养基
• 1.6 常用溶液
• 2 实验方法
• 2.1 链霉菌S27 产酶能力的验证
• 2.2 α-半乳糖苷酶基因aga-S27 的克隆
• 2.3 原核表达载体pET-28a（+）/aga-S27-H 的构建
• 2.4 重组酶Aga-S27-H的纯化
• 2.5 重组酶Aga-S27-H 酶学性质测定
• 2.6 重组酶Aga-S27-H比活性测定
• 2.7 重组酶Aga-S27-H底物特异性的测定
• 2.8 重组酶Aga-S27-H对豆粕降解能力的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 链霉菌S27 产酶能力的验证
• 3.2 α-半乳糖苷酶基因aga-S27 的克隆
• 3.3 原核表达载体pET-28a（+）/aga-S27-H的构建
• 3.4 重组酶Aga-S27-H的诱导表达与纯化
• 3.5 重组酶Aga-S27-H 酶学性质测定
• 3.6 Aga-S27-H底物特异性的测定
• 3.7 重组酶Aga-S27-H对豆粕降解能力的研究
• 4 讨论
• 本章小节
• 第六章 来源于鼠疫耶尔森氏菌91001 （Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001） α-半乳糖苷酶的基因克隆、表达和酶学性质
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 引物合成
• 1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 1.4 仪器
• 1.5 培养基
• 1.6 常用溶液
• 2 实验方法
• 2.1 α-半乳糖苷酶基因aga-Y的克隆
• 2.2 原核表达载体 pET-22b（+）/aga-Y-H 的构建
• 2.3 重组酶Aga-Y-H的纯化
• 2.4 重组酶Aga-Y-H酶学性质测定
• 2.5 重组酶Aga-Y-H比活性测定
• 2.6 重组酶Aga-Y-H底物特异性的测定
• 2.7 重组酶Aga-Y-H对豆粕降解能力的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 α-半乳糖苷酶基因aga-Y的克隆
• 3.2 原核表达载体 pET-22b（+）/aga-Y-H 的构建
• 3.3 重组酶Aga-Y-H的诱导表达与纯化
• 3.4 重组酶Aga-Y-H 酶学性质测定
• 3.5 Aga-Y-H底物特异性的测定
• 3.6 重组酶Aga-Y-H对豆粕降解能力的研究
• 4 讨论
• 本章小节
• 第七章 讨论
• 1 菌株及其诱导培养基的选择
• 1.1 诱导培养基的选择及诱导条件的探索
• 1.2 菌株的选择
• 2. 微生物36 家族α-半乳糖苷酶的分析及简并引物的设计与应用
• 3 α-半乳糖苷酶的异源表达研究
• 3.1 表达载体的选择
• 3.2 α-半乳糖苷酶在大肠杆菌中的表达位置
• 3.3 α-半乳糖苷酶在大肠杆菌中的表达条件
• 4 五个微生物来源36 家族α-半乳糖苷酶重组酶性质特点
• 4.1 分子特性及酶学性质的比较
• 4.2 动力学
• 5 五个微生物来源36 家族α-半乳糖苷酶降解能力的研究
• 5.1 天然底物降解试验
• 5.2 豆粕降解实验
• 第八章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历