高琼毛本源唐正龙冯红超
贵州医科大学附属口腔医院
摘要目的探讨涎腺恶性肿瘤中是否存在血管生成拟态及其存在的生物学及临床意义。方法采用CD31和PAS双重染色技术对本院2008年至2017年间收治的43例涎腺恶性肿瘤组织标本及正常涎腺腺体组织进行免疫组化及酶组化染色，观察涎腺恶性肿瘤中是否存在血管生成拟态并观察拟血管结构形态。结果涎腺恶性肿瘤中存在血管生成拟态。其结构为肿瘤细胞和管腔间被一层PAS染色阳性物质间隔或被PAS阳性物质填充。部分病例中可见VM结构与相邻的CD31及PAS阳性血管相通，可在管腔中发现红细胞。结论涎腺恶性肿瘤中存在血管生成拟态，而正常腺体组织中无拟血管涎腺存在。
关键词涎腺恶性肿瘤血管生成拟态血管生成
VasculogenicmimicryinmalignantsalivaryglandtumorGaoqiong,Maobenyuan.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,GuiYangMedicalCollege,Guiyang550004,China
AbstractObjectiveToexploreifthevasculogenicmimicry(VM)existinthemalignantsalivaryglandtumor,andfurthertoevaluatebiologicalandclinicalsignificance.Methods43samplesofmalignantsalivaryglandtumorwerecollectedofGuiyangMedicalCollegefrom2008to2017samplesofnormalsalivaryglandwereusedtobecontrolgroup.theimmunohistochemicaltechniqueswasusedtodetecttheexistenceoftheVM.ResultsVMexistinthemalignantsalivaryglandtumor.theVMstructureonthegroundsoftumorcellssurroundedbynon-endothelialcellsliningattachedtothepipe-likestructure.TherewasalayerofPASstaining-positivematerialsequesteredbetweentumorcellsandluminal,orfilledwithPASpositivematerial.Insomecases,VMstructureconnectedwiththeadjacentCD31andPAS-positivebloodvessels,andredbloodcellscanbefoundinthelumen.ConclusionVMexistinthemalignantsalivaryglandtumor.
Keywordsmalignantsalivaryglandtumor，Vasculogenicmimicry,Angiogenesis
中图分类号：R739.87文献标识码：A
涎腺恶性肿瘤约占涎腺肿瘤的25％，是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，对其研究有重要的临床意义。血管生成拟态（vasculogenicmimicry,VM）的发现对经典的血管生成理论提出了挑战，使人们认识到肿瘤血液供应的复杂性，是血管生成理论的有力补充。本实验采用CD31和PAS双重染色技术检测涎腺恶性肿瘤中有无拟血管现象存在，同时观察拟血管的结构特点。探讨涎腺恶性肿瘤中是否存在拟血管生成，以进一步了解涎腺恶性肿瘤的生物学行为。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验标本
收集贵阳医学院附属医院2008至2017年间收治的经手术切除、福尔马林固定、常规石蜡包埋的，并经过病理证实的涎腺恶性肿瘤组织标本共33例。正常涎腺组织标本5例（外伤及常规手术获取）。将获取的所有组织标本蜡块进行连续切片，每张厚度约为4μm，每一张组织蜡块切片三张，分别进行HE染色复查诊断、进行组织分型、CD31+PAS双重染色，另存一张，以备用。
1．1.2主要实验试剂
鼠抗人CD31单克隆抗体；PV-9000二步法免疫组化检测系统；DAB显色试剂盒（购自北京中衫金桥生物技术有限公司）。
1.2.方法
1.2.1HE染色将涎腺恶性肿瘤切片按照常规进行HE染色，光镜下观察结果，复查病理诊断。
1.2.2组织切片脱蜡和水化，进行热修复。
1.2.3滴加一抗（anti-CD31），置于4℃冰箱孵育过夜。
1.2.4滴加二抗复温后滴加1滴试剂A（聚合物增强剂），孵育20分钟，之后用PBS冲洗。擦干后每张标本切片滴加试剂B（辣根酶标记的羊抗兔/小鼠IgG聚合物），37℃孵育30分钟。
1.2.5DAB显色7分钟，待血管内皮细胞着色后，终止显色反应。
1.2．6将标本切片置于0.5%的过碘酸溶液中还原后再置于Schiff液中，反应约15分钟。取出标本切片，冲洗3次。
1.2.7复染细胞核，盐酸酒精分化，自来水返蓝。常规脱水、透明、封片，进行观察。
1.3判定标准
内皮细胞是血管壁的重要组成部分CD31是重要的内皮标志物，CD31阳性结果为主要位于细胞膜上呈棕黄色颗粒着色[2]。本实验为区别内皮依赖性血管，选择CD31作为鉴别分子。同时肿瘤细胞基底膜经PAS染色后相应部位呈淡粉色或樱桃红着色[3]。参考Maniotis的方法[4,5]，在光镜下观察，病理切片中观察到CD31标记的内皮性血管，其PAS染色也为阳性。VM为CD31染色为阴性，由肿瘤细胞构成管壁的管腔样结构。
1.4统计分析
应用SPSSforwindows11.7统计学软件包对所得的数据进行统计处理分析：各指标在组与组之间的阳性表达率比较，采用四格表卡方检验或行×列表卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，判定指标有无统计学意义；
2结果
2.1涎腺恶性肿瘤中存在血管生成拟态
33例涎腺恶性肿瘤组织标本经过CD31和PAS双重特殊免疫组化染色后，在光学显微镜下可发现，存在管壁无染成棕色的内皮细胞结构，只有淡红色的基底膜的管道样结构，构成管道样结构的肿瘤细胞间及肿瘤细胞与红细胞之间均无CD31染色阳性物质存在,表明无内皮细胞参与此管道的构建，同时在红细胞和肿瘤细胞之间有PAS阳性物质间隔，也有部分管腔中有PAS染色阳性物质填充，与Maniotis等[5]研究发现的典型的拟血管结构是由肿瘤细胞构成，管壁无内皮细胞，管腔内有红细胞存在描述的VM结构相似。本实验中33例涎腺恶性肿瘤病例中，有6例（18.2%）发现VM的结构（图1、2）。在涎腺恶性肿瘤组织切片中发现了条索状的VM结构，内无管腔，可见部分条索结构可与内皮依赖性血管相接，而内皮性血管在显微镜下可见CD31染色阳性的内皮细胞围成管腔样或网状结构，有时内皮可见PAS染色阳性的基质。（图3）而在正常涎腺组织切片中未发现血管生成拟态。
3.讨论
血管生成拟态是指由具有可塑性、侵袭性的肿瘤细胞构成的，而无内皮细胞参与条件下细胞外基质界限的管腔结构。肿瘤生长相关理论提出肿瘤的生长与转移依赖于新生血管的形成，从而使肿瘤获得丰富的营养物质和氧，减少其中心坏死的出现，更利于肿瘤的生长。由于VM无内皮细胞衬里，存在一层PAS阳性基底膜结构，肿瘤细胞可与血液直接接触，因此肿瘤细胞可获得更丰富的营养和氧。由于VM结构缺少内皮屏障，构成VM管壁结构的肿瘤细胞脱落后可直接进入血流，为肿瘤的远处转移提供了有利条件。大量研究表明VM仅存在于一些高侵袭性的恶性肿瘤中，如肾透明细胞癌、乳腺导管癌[7、8]等。因此VM存在与否与肿瘤的转移及预后密切相关。
本实验通过CD31+PAS双重染色，对涎腺恶性肿瘤标本进行染色，结果发现在涎腺恶性肿瘤中存在VM。光镜下对VM结构进行观察，发现VM结构是由肿瘤细胞构成的非内皮细胞衬附的管道或网状结构。在VM管腔中，PAS阳性物质将肿瘤细胞与管腔中的血流分隔开来，部分标本中可见PAS阳性物质填充部分管腔，在实验中还发现了，在涎腺恶性肿瘤中存在PAS阳性网络结构，该结构呈条索状，内无管腔，可见部分条索结构可与内皮依赖性血管相接。
1993年，Folberg等[8]发现，PAS染色阳性物质图案状分布的特点与葡萄膜黑色素瘤的预后密切相关。Fan等[9]在研究中发现原发性胆囊癌预后更差，VM生成是独立的预后因素之一。对VM的研究能够充分了解肿瘤供血系统的结构，进一步了恶性肿瘤的生物学行为，同时对于判断涎腺恶性肿瘤预后均具有一定的意义。本研究仅证明涎腺恶性肿瘤中可能存在VM样结构，但其生物学行为及在肿瘤生长转移中的作用均是需要进一步研究的课题。
参考文献：
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2.HandrixMJ,SeftorEA,KirschmannDA,SeftorRE.Molecularbiologyofbreastcancermatastais.Molecularexpressionofvascularmarkersbyaggressivebreastcancercell[J].BreastCancerRes,2000,2(6):417-422.
3.FossAJ,AlexanderRA,HungerfordJL,etal.ReassessmentofthePASpatternsinuvealmelanoma.BrJOphthalmol,1997,81:240-6;discussion247-8.
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5.ManiotisAJ,FolbergR,HessA,etal.Vascularchannelformationbyhumanmelanomacellsinvivoandinvitro:vasculogenicmimicry.AmJpathol,1999,155:739-52.
6.ClementeM,PereM,IlleraJ,et.al.Histologicalimmunohistologicalandultrastructuraldescriptionofvasculogenicmimicryincaninemammarycancer[J].VetPathol2009,7.
7.BattenCI,HillenF,PauwelsP,etal.Prognosticsignifrcanceofperiodicacid-schiff-positivepattemsinclearcellcarcinomal[J].CanJUrol,2009,16(4):4726-4732.
8.FolbergR,HendrixMJ,ManiotisAJ.Vasculogenicmimicryandtumorangiogenesis:AmJPathol,2000,156:361-81.
9.FanYS,SumW,ZhangWZ,etal.Vasculogenicmimicryinhumanprimarygallbladdercarcinomaandclinicalsignificancethrerof.ZhonghuaYiXueZaZhi,2007,87:145-9.
第一作者：高琼，单位：贵州医科大学口腔医学院贵州医科大学附属医院口腔颌面外科
通讯作者：唐正龙，单位：贵州医科大学口腔医学院贵州医科大学附属医院口腔颌面外科
毛本源，单位：贵阳市口腔医院
冯红超，单位：贵阳市口腔医院
马洪，贵州医科大学口腔医学院贵州医科大学附属医院口腔颌面外科