CTB-PROIN和CTB-INSB融合基因构建及其在大肠杆菌和植物中的表达

论文摘要

口服胰岛特异的自身抗原可诱导免疫耐受,防止自发性自身免疫糖尿病的发生。为使胰岛素蛋白更有效地被肠相关淋巴组织吸收,本研究分别构建了强免疫佐剂霍乱毒素B亚单位（cholera toxin B subunit, CTB）与胰岛素原（proinsulin, PROIN）和胰岛素B链（insulin B chian, INSB）的融合基因CTB-PROIN、CTB-INSB,探索了利用马铃薯生产1型糖尿病口服疫苗的可能性,主要研究内容和结果如下: 1.首先将融合基因CTB-PROIN、CTB-INSB克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a（+）中,并诱导其表达。大肠杆菌表达的融合蛋白CTB-PROIN和CTB-INSB可与GM1糖苷脂结合,并具备CTB和胰岛素的双重抗原性。 2.在此基础上,分别构建了含有土豆块茎特异性启动子Patatin、融合基因、马铃薯蛋白酶抑制剂基因Ⅱ（Pin2）的3’末端非翻译区（UTR）序列和NOS终止子的两个植物转化载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯,并获得含有融合基因的转基因马铃薯植株。转基因植物表达的融合蛋白具有霍乱毒素和胰岛素的双重抗原性,可于神经节苷脂GM1结合,具有潜在的生物活性。这为利用转基因马铃薯免疫NOD小鼠,进一步分析其免疫特性奠定了基础。

论文目录

• 插图和附表清单
• 缩略语
• 第一章 引言
• 1.1 1型糖尿病
• 1.1.1 糖尿病流行状况
• 1.1.2 糖尿病的分类
• 1.1.3 1型糖尿病
• 1.2 1型糖尿病的传统治疗研究
• 1.2.1 异体、异种移植治疗
• 1.2.2 药物治疗
• 1.2.3 疫苗治疗研究
• 1.2.4 基因免疫治疗
• 1.2.5 细胞治疗
• 1.3 口服胰岛素诱导免疫耐受
• 1.3.1 口服抗原诱导免疫耐受的机制
• 1.3.2 旁路抑制机制
• 1.3.3 口服胰岛素诱导免疫耐受研究进展
• 1.3.4 佐剂
• 1.4 CTB治疗自身免疫性疾病
• 1.5 转基因植物疫苗
• 1.5.1 转基因植物疫苗的优越性
• 1.5.2 利用转基因植物研究1型糖尿病口服疫苗
• 第二章 CTB-PROIN和CTB-INSB融合基因构建及其在大肠杆菌和植物中的表达
• 第一部分 CTB-PROIN和CTB-INSB融合基因构建及其在大肠杆菌中的表达
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 菌株和质粒
• 2.1.1.2 工具酶与生物学试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验中所用的溶液、缓冲液、培养基
• 2.1.4 实验方法
• 2.1.4.1 质粒DNA的小量制备
• 2.1.4.2 PCR扩增基因片段
• 2.1.4.3 TBE-agarose电泳和DNA片段的回收（透析袋电洗脱法）
• 2.1.4.4 大肠杆菌菌株DH5α感受态的制备与转化
• 2.1.4.5 DNA的限制性酶切反应和DNA片段连接反应
• 2.1.4.6 DNA序列测定
• 2.1.4.7 重组蛋白的诱导表达
• 2.1.4.8 大肠杆菌表达重组包涵体蛋白的纯化
• 2.1.4.9 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.1.4.10 SDS聚丙烯酰胺凝胶染色
• 2.1.4.11 Western印迹
• 2.1.4.12 GM1 ELISA
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 CTB-PROIN融合基因的克隆、表达及重组蛋白特性分析
• 2.2.1.1 CTB-PROIN融合基因的克隆及序列测定
• 2.2.1.2 CTB-PROIN融合基因原核表达载体构建与鉴定
• 2.2.1.3 CTB-PROIN融合基因的诱导表达及表达量测定
• 2.2.1.4 CTB-PRON融合蛋白的Western blotting检测
• 2.2.1.5 CTB-PROIN融合蛋白的体外生物活性分析
• 2.2.2 CTB-INSB融合基因的克隆、表达及重组蛋白特性分析
• 2.2.2.1 CTB-INSB融合基因的克隆及序列测定
• 2.2.2.2 CTB-INSB融合基因原核表达载体构建与鉴定
• 2.2.2.3 CTB-INSB融合基因的诱导表达及纯化
• 2.2.2.4 CTB-INSB融合蛋白的Western blotting检测
• 2.2.2.5 CTB-INSB融合蛋白与GM1神经节苷脂的结合
• 2.3 讨论
• 第二部分 CTB-PROIN和CTB-INSB融合基因在转基因马铃薯中的表达
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 菌株和质粒
• 3.1.1.2 植物材料
• 3.1.1.3 工具酶与生物学试剂
• 3.1.2 实验器材
• 3.1.3 实验中所用的溶液、缓冲液、培养基
• 3.1.4 实验方法
• 3.1.4.1 质粒DNA的小量制备
• 3.1.4.2 PCR扩增基因片段
• 3.1.4.3 TBE-agarose电泳和DNA片段的回收（透析袋电洗脱法）
• 3.1.4.4 大肠杆菌菌株DH5α感受态的制备与转化
• 3.1.4.5 DNA的限制性酶切反应和DNA片段连接反应
• 3.1.4.6 DNA序列测定
• 3.1.4.7 根癌农杆菌的三亲杂交
• 3.1.4.8 转基因植物材料的准备
• 3.1.4.9 植物的遗传转化
• 3.1.4.10 转基因植株的分子鉴定
• 3.1.4.11 植物表达重组蛋白的提取
• 3.1.4.12 转基因植株表达量检测
• 3.1.4.13 植物表达重组蛋白的Western blotting检测
• 3.1.4.14 植物表达重组蛋白的GM1-ELISA检测
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 CTB-PROIN融合基因植物表达载体构建及其在马铃薯中的表达
• 3.2.1.1 CTB-PROIN融合基因植物表达载体设计与基因克隆
• 3.2.1.2 CTB-PROINS融合基因植物表达载体构建及鉴定
• 3.2.1.3 含融合基因CTB-PROINS的农杆菌的获得
• 3.2.1.4 含融合基因CTB-PROINS的转基因马铃薯的获得及检测
• 3.2.1.5 CTB-PROINS转基因马铃薯表达量检测
• 3.2.1.6 CTB-PROINS转基因马铃薯的western blotting检测
• 3.2.1.7 CTB-PROINS转基因马铃薯的GM1-ELISA检测
• 3.2.2 CTB-INSB融合基因植物表达载体构建及其在马铃薯中的表达
• 3.2.2.1 CTB-INSB融合基因植物表达载体设计与基因克隆
• 3.2.2.2 CTB-INSB融合基因植物表达载体构建及鉴定
• 3.2.2.3 含融合基因CTB-INSB的农杆菌的获得
• 3.2.2.4 含融合基因CTB-INSB的转基因马铃薯的获得及检测
• 3.2.2.5 CTB-INSB转基因马铃薯表达量检测
• 3.2.2.6 CTB-INSB转基因马铃薯的western blotting检测
• 3.2.2.7 CTB-INSB转基因马铃薯的GM1-ELISA检测
• 3.3 讨论
• 第三章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 溶液、缓冲液、培养基配方