超微和普通生脉散对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用和机制的比较研究

论文摘要

背景心肌细胞发生缺血再灌注损伤（RI）时,细胞的钙调控发生改变,肌浆网的钙摄取功能和肌膜钙ATP酶受到抑制,钙离子在细胞内蓄积,形成钙超载;细胞内过多的钙离子可激活胞内的磷脂酶A2,使细胞膜磷脂分解,由黄嘌呤氧化酶途径生成大量的氧自由基,后者直接造成心肌细胞损伤,所以细胞内的钙超载和氧自由基产生增多是造成损伤的重要原因。心肌缺血再灌注损伤最常见的表现包括心肌酶谱的变化、各种心律失常和心肌顿抑。西医缺少积极的防治办法,中医治疗能起到一定的疗效。生脉散及其注射剂是临床广为应用的益气补阴固脱的方剂,其抗心肌缺血再灌注损伤（RI）的作用备受关注。超微饮片是近年来新研制的一种中药饮片,目前许多研究表明超微饮片不仅可以替代传统饮片用于临床,而且可以加速药物成分的吸收,减少药物的剂量。关于超微生脉散在抗心肌缺血再灌注损伤（RI）的作用目前缺少研究。目的1.通过对超微生脉散和普通生脉散抗心肌RI的对比研究,为超微饮片的进一步研究和开发应用提供理论依据。2.探索生脉散在抗RI过程中的抗细胞内钙超载作用的调控机制,研究超微生脉散和普通生脉散对心肌RI模型细胞内钙离子浓度的影响和对心肌细胞钙调节蛋白SERCA2、RYR2的mRNA表达的影响。方法1.用结扎30min/松开大鼠左冠状动脉前降支的方法造成再灌注损伤模型。在实验前60min,分别给予生理盐水和药物,分组为:正常组（C）、模型组（M）,普通生脉散低剂量治疗组（T1）、普通生脉散中剂量治疗组（T2）、普通生脉散高剂量治疗组（T3）、超微生脉散低剂量治疗组（F1）、超微生脉散中剂量治疗组（F2）、超微生脉散高剂量治疗组（F3）。实验中观察心律失常的发生情况。再灌注180分钟后,取血分离血清,检测LDH、CK-MB、MDA、SOD。摘取心脏,免疫组化测Bax、Bcl-2和caspase-3的表达。2.培养SD乳鼠心肌细胞,用缺氧/复氧法造成培养心肌细胞损伤模型,复氧同时分别给予空白血清冻干粉或含药血清冻干粉,细胞分组同前。分组处理后,正常培养24h,各组检测心肌细胞活力、细胞内钙离子浓度,继而用RT-PCR方法检测钙调节蛋白SERCA2、RyR2的mRNA表达。结果1.生脉散对大鼠急性心肌缺血再灌注性心律失常的影响:再灌注180min内,模型组大鼠再灌注性心律失常的总发生率为83.3%（10/12）,各种心律失常的发生率较缺血阶段高,并出现了室性颤扑,死亡率25.0%。普通生脉散低剂量组死亡率11.1%,其它各组无死亡。各生脉散治疗组各种再灌注性心律失常的发生率均有降低,以超微生脉散中、高剂量组和普通生脉散高剂量组尤为明显,降至44.4%（4/9）,二者与模型组比较,差异有非常显著性意义（p＜0.01）。2.生脉散对缺血再灌注大鼠LDH、CK-MB的影响:模型组心肌酶LDH、CK-MB均较假手术组升高,分别为1615±176、665.4±39.8u/L和742±153、289.2±42.5u/L,两组比较差异有非常显著性意义（p＜0.01）。各治疗组的LDH、CK-MB也均高于假手术组,但低于模型组,与模型组比较,差异有非常显著性意义（p＜0.01）。同等剂量的超微生脉散和普通生脉散相比,超微生脉散降低缺血再灌注损伤所致LDH、CK-MB升高的作用更为明显,差异有非常显著性意义（p＜0.01）。3.生脉散对缺血再灌注大鼠MDA、SOD的影响:模型组MDA均较假手术组升高,分别为6.31±0.52和0.32±0.14nmol/ml,各治疗组MDA也较假手术组升高,它们和假手术组比较,差异均有非常显著性意义（p＜0.01）。各生脉散治疗组MDA均低于模型组,与模型组比较差异有非常显著性意义（p＜0.01）。同等剂量的超微生脉散和普通生脉散相比,各超微生脉散组的MDA值均低于同等剂量的普通生脉散组的MDA值,两者差异有显著性（p＜0.05）。与MDA的变化相反,模型组SOD较假手术组降低,分别为34.5±15.4和89.6±11.5umol/ml,和假手术组比较差异有非常显著性意义（p＜0.01）。各生脉散治疗组SOD均高于模型组、低于假手术组,和假手术组及模型组比较差异均有非常显著性意义（p＜0.01）。同等剂量的超微生脉散和普通生脉散相比,超微生脉散升高SOD的作用更为明显,两者差异有显著性（P＜0.05）,其中超微生脉散高、中剂量组和普通生脉散高剂量组的SOD值略低于假手术组,但与假手术组比较无显著性差异（P＞0.05）。4.生脉散对Bcl-2表达的影响:模型组及各生脉散组Bcl-2的表达较假手术组明显降低,与假手术组比较差异有非常显著性意义（p＜0.01）;同时,各生脉散组Bcl-2表达均高于模型组,与模型组比较差异有非常显著性意义（p＜0.01）;同剂量的超微生脉散组与普通生脉散组相比,超微生脉散组Bcl-2表达均高于普通生脉散组（P＜0.05）。生脉散对Bax和caspase-3的表达的影响:模型组及各生脉散组Bax和caspase-3的表达较假手术组明显增加,与假手术组比较差异有非常显著性意义（p＜0.01）;同时,各生脉散组Bax和caspase-3的表达均低于模型组,与模型组比较差异有非常显著性意义（p＜0.01）;同剂量的超微生脉散组与普通生脉散组相比,超微生脉散高、中剂量组caspase-3的表达均低于同剂量普通生脉散组,两者比较差异有显著性意义（P＜0.05）。5.超微和普通生脉散对缺氧复氧心肌细胞活力的影响:模型组心肌细胞严重受损,心肌细胞活力较正常对照组降低,与对照组相比差异有非常显著性意义（p＜0.01）。预先加入生脉散血清,可见（?）治疗组细胞存活率高于模型组,差异有非常显著性意义（p＜0.01）。说明生脉散血清可以提高RI致心肌细胞损伤时细胞的活力。将超微生脉散和普通生脉散相比较,可以发现,同等剂量超微生脉散血清作用强于普通生脉散。6.超微和普通生脉散对RI心肌细胞内钙的影响:经缺氧复氧处理后,模型组心肌细胞内的钙（112.57±10.97）比正常对照组（75.15±4.87）显著升高,各生脉散治疗组的心肌细胞内钙也较正常对照组有较大幅度升高,但较模型组有不同程度下降,与正常对照组和模型组比较,差异均有非常显著性意义（p＜0.01）,提示生脉散血清能抑制缺氧复氧造成的心肌细胞内钙超载。将超微生脉散和普通生脉散血清作用相比较,可以发现,无论是在提高缺氧复氧损伤后所致的心肌细胞活力下降方面,还是在降低缺氧复氧损伤后所致的心肌细胞内钙超载方面,同剂量超微生脉散血清作用均强于普通生脉散血清,两者比较差异均有显著性（P＜0.05）,且在实验所用的三种剂量情况下,剂量较高者作用相对较强,但超微生脉散高、中浓度血清治疗组组间差异并不显著（P＞0.05）,提示在提高心肌细胞活力及抑制心肌细胞内钙超载方面,超微生脉散中等剂量水平即基本上能达到高剂量水平的效果。7.超微和普通生脉散对RI心肌细胞SERCA2、RyR2的mRNA表达的影响:模型组心肌细胞SERCA2、RyR2的mRNA表达均较正常对照组降低,其相对表达量分别为0.48±0.11、0.47±0.09和0.79±0.09、0.80±0.11,两者比较差异有非常显著性意义（p＜0.01）。各生脉散组SERCA2、RyR2的mRNA表达量也较正常对照组低,但高于模型组,与两者比较,差异均有非常显著性意义（p＜0.01）;将同剂量超微生脉散组和普通生脉散组比较,可以发现前者提高SERCA2、RvR2的mRNA的表达作用强于普通生脉散,两者比较差异均有显著性（P＜0.05）,且在实验所用的高、中、低三种剂量情况下,剂量较高者作用相对较强,但超微生脉散高、中浓度血清治疗组组间差异并不显著（P＞0.05）。结论1.本研究的结果表明,超微生脉散不仅可以替代普通生脉散发挥抗RI的作用而且在同等剂量下,其作用更强。2.生脉散抗心肌RI的作用,与其抗心肌细胞内钙超载密切相关。本研究首次表明,生脉散抗心肌细胞内钙超载的作用,可能与上调心肌细胞SERCA2、RyR2 mRNA的表达密切相关。这为临床使用超微生脉散治疗心肌RI提供了依据。

论文目录

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引言

第一部分.生脉散及其超微颗粒抗心肌缺血再灌注损伤的研究背景

一中医对心肌缺血再灌注损伤的认识

1 现代医学对心肌缺血再灌注损伤的概念的提出

2 心肌缺血再灌注损伤主要相当于中医真心痛的邪去正虚阶段

3 中医对真心痛的认识

二关于生脉散治疗心肌缺血再灌注损伤的研究

1 生脉散的组成和意义

2 生脉散抗心肌缺血再灌注损伤的现代研究

3 生脉散的药理成分的代谢研究

三中药散剂和超微饮片的研究现状

1 传统中药散剂的应用

2 中药现代化的积极探索

3 近年来对超微饮片的研究

4 超微生脉散的前期研究

参考文献

第二部分超微和普通生脉散对大鼠急性RI心肌保护作用的实验研究

一超微和普通生脉散对大鼠急性RI心肌保护作用的在体实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

二超微和普通生脉散对大鼠缺氧复氧损伤心肌细胞保护作用的比较研究