鸭肠炎病毒UL15及UL41基因的鉴定

论文摘要

鸭肠炎病毒（DEV）,又称鸭疱疹病毒I型,是鸭、鹅及天鹅等雁形目水鸟的一种重要病原体,可引起急性、接触性传染的鸭病毒性肠炎（DVE）,该病在家养及野生水禽中可造成高死亡率及产蛋下降。DEV基因组DNA序列的测定工作直到最近2年才陆续完成,而其编码基因的确定大多仅停留在与其他疱疹病毒同源基因的序列分析基础上,对蛋白编码基因的探索有助于我们更好地了解该病毒的生物学特征。为此,本研究开展了DEV UL15和UL41基因及其编码蛋白的鉴定和分析工作。DEV UL15由2个外显子和1个3.5 kb的内含子组成,其编码序列可转录2个转录本:全长的UL15及N-末端截断的UL15.5。2.9 kb的UL15转录本编码一739个氨基酸的蛋白质,其分子量大小约为82 kDa,而UL15.5转录本长约1.3 kb,包含888 bp的ORF,该ORF编码一大小约为32 kDa的多肽。序列分析表明UL15编码序列在疱疹病毒科内高度保守,并且含有2个在疱疹病毒及噬菌体末端酶催化亚基序列中保守的Walker A （261VPRRHGKT267）和Walker B （354LLFVDE359）基序。基于23个疱疹病毒UL15的氨基酸序列构建的系统发育树表明DEV与α疱疹病毒亚科,Mardivirus病毒属内病毒亲缘关系较近。此外,DEV UL15的转录和表达对放线菌酮（CHX）和膦乙酸（PAA）均敏感,说明UL15在DEV复制过程中晚期表达。Western blot结果显示,抗UL15C232的抗血清可在DEV感染的细胞内检测到UL15和UL15.5的表达,而在纯化的病毒粒子中检测不到蛋白的存在。间接免疫荧光结果显示,在感染早期（6 hpi） UL15定位在CEF细胞的细胞质中,到12 hpi和24 hpi时则转运进入细胞核,而在无其他病毒蛋白参与下,UL15则滞留在细胞质内。UL41的同源蛋白编码病毒宿主关闭蛋白（VHS）,可非特异性的降解宿主及病毒mRNA。PSI-BLAST搜索显示,DEV UL41氨基酸序列具有核酸酶家族蛋白特征,且模拟的3D空间结构也与T4 RNase H和Taq DNA聚合酶的活性区域很好的叠合。此外,基于UL41氨基酸序列构建的系统发育树分析发现DEV与Mardivirus内病毒亲缘关系较近。为进一步分析编码蛋白特性,将UL41 ORF克隆至表达载体pMAL-c4x中,原核表达了可溶性全长融合蛋白MBP-UL41,并制备了抗UL41的抗血清。随后的体外VHS活性检测发现,融合蛋白具有RNase活性。CEF细胞内瞬时表达的UL41可致共转染的报告基因Luc表达量降低,证实了细胞内表达的UL41蛋白的RNase活性。此外,时序性分析发现UL41基因的表达对CHX敏感,而对PAA不敏感,说明UL41是早期表达基因。Western blot结果显示,DEV感染的细胞内可检测到UL41蛋白的存在,DEV病毒粒子中也含有UL41蛋白。在DEV感染的CEF细胞内,UL41定位在细胞质的核周区域,感染早期呈颗粒性聚集分布。在pcDNA-UL41转染的细胞中,瞬时表达的UL41主要位于细胞质的核周区域,细胞核中也有少量分布。最后,UL41蛋白上的保守性氨基酸残基的单点突变可导致蛋白的VHS活性的降低或丧失。综合突变分析及同源蛋白预测的结果推测,D253和D299可能是蛋白上的一个配体结合位点。综上所述,本研究鉴定了DEV的UL15和UL41基因和/或其编码的蛋白,为明确DEV病毒在疱疹病毒科的分类地位以及阐明这2个蛋白在DEV感染中的作用提供了实验数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 鸭病毒性肠炎概述
• 1.1.1 病因学及流行病学
• 1.1.2 临床表现
• 1.1.3 病理病变
• 1.1.4 DVE 的诊断
• 1.1.5 鸭病毒性肠炎的防制
• 1.2 鸭肠炎病毒生物学特性
• 1.2.1 DEV 的分类学地位
• 1.2.2 形态特征
• 1.2.3 理化特性
• 1.2.4 培养特性
• 1.2.5 抗原性
• 1.2.6 DEV 的形态发生与细胞的超微结构变化
• 1.3 DEV 分子生物学研究进展
• 1.3.1 DEV 基因组序列的测定
• 1.3.2 DEV 基因组结构
• 1.4 α-疱疹病毒的复制
• 1.4.1 病毒吸附并进入宿主细胞
• 1.4.2 脱去外膜的衣壳进入细胞核
• 1.4.3 重塑宿主细胞核
• 1.4.4 病毒基因表达
• 1.4.5 病毒DNA 复制
• 1.4.6 病毒衣壳包装
• 1.4.7 病毒子释放
• 1.5 UL15 的基因结构及编码蛋白功能
• 1.6 病毒宿主关闭蛋白（UL41）的功能
• 1.6.1 疱疹病毒诱导宿主关闭的一般特征
• 1.6.2 VHS 的作用机理
• 1.6.3 VHS 的生物学功能
• 1.7 研究的目的和意义
• 第二章 鸭肠炎病毒UL15 基因及其编码蛋白的鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 病毒与细胞
• 2.1.2 质粒与菌种
• 2.1.3 试剂盒、限制性酶类及主要生化试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 DEV 在CEF 上的增殖及滴度测定
• 2.1.7 DEV 病毒的纯化
• 2.1.8 CEF 总RNA 的提取
• 2.1.9 RT-PCR 法扩增UL15 基因编码序列
• 2.1.10 UL15 基因剪切位点的确定
• 2.1.11 地高辛标记的Northern blot 探针的制备
• 2.1.12 探针标记效率的测定
• 2.1.13 RNA 的变性电泳及转膜
• 2.1.14 RNA 的固定及Northern 杂交
• 2.1.15 DEV 感染CEF 细胞mRNA 的纯化
• 2.1.16 5′-cDNA 末端快速扩增（5′-RACE）
• 2.1.17 3′-cDNA 末端快速扩增（3′-RACE）
• 2.1.18 DEV UL15 基因的序列分析
• 232 原核载体的构建'>2.1.19 pET-UL15C²³²原核载体的构建
• 232 融合蛋白在 E.coli 中的表达及纯化'>2.1.20 6×His-UL15C²³² 融合蛋白在 E.coli 中的表达及纯化
• 232 抗血清的制备'>2.1.21 兔抗 6×His-UL15C²³²抗血清的制备
• 2.1.22 Western blot
• 2.1.23 UL15 基因表达时相分析
• 2.1.24 UL15 真核表达质粒的构建及中量提取
• 2.1.25 UL15 在CEF 细胞上的瞬时表达
• 2.1.26 UL15 基因产物在CEF 细胞中的定位
• 2.2 结果
• 2.2.1 DEV 病毒的增殖与纯化结果
• 2.2.2 UL15 RT-PCR 扩增结果
• 2.2.3 UL15 Northen 探针的标记结果
• 2.2.4 UL15 Northern blot 结果
• 2.2.5 UL15 基因剪切位点的确定
• 2.2.6 UL15 基因末端序列的扩增结果
• 2.2.7 UL15 基因的序列分析结果
• 232 融合蛋白抗血清的制备'>2.2.8 6×His-UL15C²³²融合蛋白抗血清的制备
• 2.2.9 Western blot 检测感染细胞内UL15 蛋白的表达
• 2.2.10 UL15 基因的表达时相结果
• 232 抗血清的反应性'>2.2.11 病毒粒子与兔抗UL15C²³²抗血清的反应性
• 2.2.12 UL15 基因在CEF 中的瞬时表达
• 2.2.13 UL15 表达产物在CEF 中的亚细胞定位
• 2.3 讨论
• 2.3.1 DEV UL15 基因结构
• 2.3.2 UL15.5 基因的序列分析
• 2.3.3 DEV UL15 可能的功能
• 2.3.4 DEV 的分类地位-基于UL15 氨基酸序列的分析
• 232 的原核表达'>2.3.5 UL15C²³²的原核表达
• 2.3.6 UL15 的表达时序性
• 2.3.7 UL15 在病毒粒子中的存在性
• 2.3.8 UL15 在感染细胞中的亚细胞定位
• 第三章 鸭肠炎病毒UL41 基因及其编码蛋白的鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 病毒与细胞
• 3.1.2 质粒与菌种
• 3.1.3 试剂盒、限制性酶类及主要生化试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 引物
• 3.1.6 DEV UL41 的序列分析
• 3.1.7 PCR法扩增UL41及US3基因序列
• 3.1.8 UL41 蛋白的原核表达
• 3.1.9 可溶性MBP-VHS 融合蛋白的纯化
• 3.1.10 VHS 底物RNA 的制备
• 3.1.11 RNA 的提取及电泳
• 3.1.12 体外VHS 活性检测
• 3.1.13 兔抗GST-UL41 抗血清的制备
• 3.1.14 Western blot
• 3.1.15 UL41 基因表达时相分析
• 3.1.16 UL41 真核表达质粒的构建及中量提取
• 3.1.17 UL41 在CEF 细胞上的瞬时表达
• 3.1.18 UL41 基因产物在CEF 细胞中的定位
• 3.1.19 UL41 的定点突变
• 3.1.20 瞬时表达UL41 的VHS 活性检测
• 3.2 结果
• 3.2.1 UL41 序列分析结果
• 3.2.2 UL41 及US3的PCR结果
• 3.2.3 UL41 的原核表达
• 3.2.4 UL41 的纯化
• 3.2.5 US3 体外转录物的制备
• 3.2.6 UL41 的体外VHS 活性检测
• 3.2.7 兔抗DEV UL41 血清的反应性
• 3.2.8 UL41 在DEV 感染的CEF 中的表达
• 3.2.9 UL41 基因的表达时相结果
• 3.2.10 Western blot 检测DEV 病毒粒子中的UL41
• 3.2.11 UL41 在感染细胞中的亚细胞定位
• 3.2.12 UL41 的瞬时表达及其VHS 活性的测定
• 3.2.13 UL41 突变体表达载体的构建及瞬时表达
• 3.2.14 定点突变的UL41 VHS 活性检测
• 3.2.15 保守性氨基酸位点的功能分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 DEV UL41 的序列分析
• 3.3.2 DEV 的分类地位-基于UL41 的分析
• 3.3.3 UL41 的可溶性表达及纯化
• 3.3.4 UL41 表达的时序性
• 3.3.5 UL41 是病毒粒子的组成部分
• 3.3.6 UL41 在感染细胞中的分布
• 3.3.7 UL41 的VHS 活性
• 3.3.8 VHS 活性的关键位点
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历