雏鸵鸟HPA轴的形态学、发育学及其在ND应激下的调控机理研究

论文摘要

鸵鸟是世界上现存体形最大不能飞行的鸟纲动物,具有很高的饲养价值。雏鸵鸟由于各种生理机能尚未健全,抵抗力低,对机体内外环境的变化和病原的侵袭非常敏感,容易发生应激反应。因此,此阶段下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）功能的完善程度决定着机体的应激反应能力,最终影响雏鸵鸟的生长发育。新城疫（ND）是鸵鸟养殖业中最主要的传染病之一,雏鸟的发病率高达50%。ND作为应激原,进入机体后可引起一系列病理变化,使机体HPA轴处于过度激活或失活状态,进一步加重内环境紊乱,引起病情加重。鉴于此,本研究以雏鸵鸟为试验动物,分正常组（0d、45d和90d）和攻毒组(45d,皮下注射鸡新城疫标准毒株F48E9),利用HE染色技术、透射电镜（TEM）技术、组织化学技术、放射免疫测定（RIA）技术、免疫组化技术定位表达（SABC）技术及原位缺口末端标记（TUNEL）技术等多种手段,从组织、细胞、亚细胞、细胞因子等方面系统研究雏鸵鸟HPA轴的形态结构、发育特点及ND应激下的调控机理。主要研究内容和研究结果包括以下几个方面:1雏鸵鸟HPA轴的形态结构本试验以1d、45d和90d健康非洲雏鸵鸟为试验动物,通过光镜和电镜样本制作,采用石蜡切片及HE技术,研究雏鸵鸟HPA轴的形态结构。结果显示:雏鸵鸟HPA轴有其自身的特点,其肾上腺结构与其它鸟类的有差异。雏鸵鸟的左右肾上腺形态、大小、位置有一定的差异,左侧肾上腺呈长椭圆形,右侧肾上腺呈三角形或扁椭圆形,较左侧的宽,重。肾上腺实质由肾间组织（皮质）和嗜铬细胞（髓质）交错排列,肾上腺皮质组织分为周围带和中央带,周围带可分为外区（被膜下带）和内区。周围带外区细胞的排列似乎与哺乳动物球状带的相似,内区细胞排列相似于哺乳动物束状带的,中央带细胞排列相似于哺乳动物网状带的,这是鸵鸟肾上腺成带的重要标志。相比于位于肾上腺内层（周围带内区和中央带）的细胞,被膜下带细胞的胞质染色较淡,且含有若干空泡。此外,和中央带细胞不同,被膜下带细胞似乎含有更多的线粒体和较少的脂滴。肾上腺髓质细胞排列成索,含有两种嗜铬细胞,即肾上腺素细胞和去甲肾上腺素细胞。它们均含较丰富的细胞器和大量的分泌颗粒,颗粒表面有膜包裹,内含核芯。其主要区别:肾上腺素细胞的分泌颗粒,其核芯多位于中央,核芯与界膜之间有一狭窄的空晕;去甲肾上腺素细胞的分泌颗粒,其核芯偏于颗粒一侧并贴于界膜上,而使颗粒的另一侧留下一个较大的腔隙。以上结果表明,雏鸵鸟HPA轴的形态结构与其它禽类的有差异,其肾上腺的形态结构与部分哺乳动物的相似。2雏鸵鸟HPA轴的发育特点本研究以1d、45d和90d健康非洲雏鸵鸟为试验动物,利用HE染色技术、TEM技术、RIA技术、免疫组织化学SABC技术及TUNEL技术,研究雏鸵鸟HPA轴的发育特点。研究结果显示:雏鸵鸟HPA轴组织学结构随日龄的增长而不断完善,其在生后早期发育较快,45d时肾上腺皮质分区明显,髓质明显增多,细胞器明显增多。不同日龄雏鸵鸟HPA轴内均存在细胞凋亡现象,但凋亡程度有所不同,1d鸵鸟下丘脑内神经细胞凋亡较多（P＜0.01）,之后凋亡逐渐减少;垂体内细胞凋亡较少,凋亡呈增龄性减少;1d鸵鸟肾上腺内的细胞凋亡较少,45d时凋亡明显增多（P＜0.01）,90d时有所减少。不同日龄雏鸵鸟HPA轴内均可检测到GABA阳性产物,随日龄的增长,其表达量呈增加的趋势,平均积分光密度则在不同器官内呈不同的规律性变化;下丘脑内GABA阳性产物表达量较高,45d时的平均积分光度较高（P＜0.01）;垂体内GABA阳性产物表达量较低,其平均积分光度随日龄逐渐下降;肾上腺内GABA阳性产物表达量较低,阳性信号呈增龄性增强,90d时平均积分光度达到最高（P＜0.01）。雏鸵鸟血清ACTH和Cor水平随年龄增长有明显变化。1d鸵鸟血清ACTH水平在1～45d之间呈上升趋势,之后下降至低于1d的水平（P＜0.01）;雏鸵鸟血清Cor水平在1～45d之间呈下降的趋势,之后渐回升到1d的水平。以上研究结果表明,随着日龄的增长,雏鸵鸟HPA轴的结构和功能不断完善,其在生后早期发育较快。3雏鸵鸟ND应激下的HPA轴调控机理将试验动物随机分为攻毒组和对照组。利用HE染色技术、TEM技术、RIA技术、免疫组织化学SABC技术及TUNEL技术,研究雏鸵鸟ND应激下的HPA轴调控机理。研究结果显示:NDV可引起雏鸵鸟HPA轴发生明显的组织病理学变化,肾上腺病变较严重,下丘脑次之,垂体病变较轻,其病变程度显示了雏鸵鸟HPA轴功能受损程度。雏鸵鸟感染NDV,HPA轴内细胞凋亡数量在病毒感染期间明显高于对照组,提示NDV能诱导雏鸵鸟HPA轴系统发生细胞凋亡;在病毒接种后1d,肾上腺内可检测到大量凋亡细胞,接种5d后凋亡数量显著增加（P＜0.01）,之后凋亡呈下降趋势,肾上腺内细胞凋亡的动态变化反映了雏鸵鸟HPA轴对ND病变的适应和调节。雏鸵鸟感染NDV,HPA轴内GABA表达均下降,肾上腺内GABA阳性产物数量在接种后第1d急剧减少（P＜0.01）,至第3d最低（P＜0.01）,之后随着病毒接种时间的延长,其表达量有所回升,但仍低于与对照组,肾上腺内GABA表达量的消长规律提示GABA可能参与了ND应激下的应激反应过程。雏鸵鸟感染NDV,血清ACTH水平于NDV病毒接种后第1d开始上升,至第5d达峰值（P＜0.01）,之后有所下降,渐趋于正常。血清Cor水平于病毒接种后第1d开始下降,至第7d有所回升,第9d渐趋于正常水平,表明NDV接种后雏鸵鸟血清ACTH和Cor水平的变化与其HPA轴功能的损伤及恢复密切相关。

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Abstract

缩略语表

第1章前言

1 立题依据

2 文献综述

2.1 鸵鸟研究现状

2.2 下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）功能调节

2.2.1 HPA轴结构及分泌激素

2.2.2 HPA轴机能调节

2.2.3 生长发育与HPA轴

2.2.4 应激与HPA轴

2.2.5 γ-氨基丁酸（GABA）与HPA轴

2.2.6 HPA轴细胞凋亡

2.3 新城疫（ND）

2.3.1 新城疫病毒（NDV）的生物学特性

2.3.2 鸵鸟ND的流行病学特征

2.3.3 鸵鸟ND的临床症状和病理变化

2.3.4 鸵鸟ND的检测

3 本研究的目的和意义

第2章非洲雏鸵鸟下丘脑-垂体-肾上腺轴的形态学研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验动物

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3 主要药品及试剂

2.1.4 试剂及染液的配制

2.2 试验方法

2.2.1 样品采集与处理

2.2.2 样本制作

2.2.3 组织固定后的处理

2.2.4 垂体Orange G-Acid Fuchsin-Light Green（OFG）染色

3 结果

3.1 雏鸵鸟下丘脑的结构特点

3.2 雏鸵鸟垂体的结构特点

3.3 雏鸵鸟肾上腺的结构特点

3.3.1 解剖学结构

3.3.2 显微结构

3.3.3 超微结构

4 讨论

4.1 雏鸵鸟下丘脑和垂体的结构特点

4.2 雏鸵鸟肾上腺的解剖学特点

4.3 雏鸵鸟肾上腺的显微结构特点

4.4 雏鸵鸟肾上腺的超微结构特点

5 小结

第3章雏鸵鸟下丘脑-垂体-肾上腺轴的发育学研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验动物

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3 主要药品及试剂

2.2 试验方法

2.2.1 样品采集与处理

2.2.2 样本制作

2.2.3 TUNEL法检测细胞凋亡

2.2.4 免疫组化SABC法染色

2.2.5 ACTH、Cor放射免疫测定

3 结果

3.1 雏鸵鸟HPA轴的发育组织学特点

3.2 不同日龄雏鸵鸟HPA轴内细胞凋亡特点

3.3 不同日龄雏鸵鸟HPA轴内GABA的分布

3.4 不同日龄雏鸵鸟血清中ACTH和Cor水平的变化

4 讨论

4.1 雏鸵鸟HPA轴发育的组织学特点

4.2 不同日龄雏鸵鸟HPA轴内细胞凋亡的变化特点

4.3 不同日龄雏鸵鸟HPA轴内GABA的分布特点

4.4 不同日龄雏鸵鸟血清激素水平的变化特点

5 小结

第4章雏鸵鸟ND应激下的HPA轴调控机理研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 病毒毒株

2.1.2 试验动物

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 主要药品及试剂

2.2 试验方法

2.2.1 病毒接种

2.2.2 样本取材

2.2.3 样本制作

2.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡

2.2.5 免疫组化SABC法染色

2.2.6 ACTH、Cor放射免疫测定

3 结果

3.1 临床症状及剖检病变

3.2 感染NDV雏鸵鸟 HPA轴的病理组织学变化

3.3 感染NDV雏鸵鸟HPA轴细胞凋亡的变化

3.4 感染NDV雏鸵鸟HPA轴内GABA表达的变化

3.5 感染NDV期间血清ACTH和Cor的变化

4 讨论

4.1 感染NDV雏鸵鸟 HPA轴的病理组织学特点

4.2 感染NDV雏鸵鸟 HPA轴的细胞凋亡变化特点

4.3 GABA在ND应激下的HPA轴调控中的作用

4.4 感染NDV雏鸵鸟HPA轴激素水平的动态变化

5 小结

结论

本研究的主要创新点

下一步研究计划

参考文献

致谢

附录 1 个人简介

附录 2 攻读博士学位期间以第一作者发表的论文

附录 3 攻读博士学位期间参加的学术交流活动

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