猪圆环病毒2型感染分子诊断与防制的相关研究

论文摘要

猪圆环病毒感染是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的种新传染病,母猪表现为繁殖障碍,仔猪和断奶猪主要特征为猪体质下降,消瘦,呼吸困难,咳喘,腹泻和黄疸等。PCV2与多种猪病相关,主要引起仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、繁殖障碍、猪呼吸道综合征、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴腺炎、渗出性皮炎和仔猪先天性震颤等。尤其PMWS,该病最早于1991年在加拿大西部发现,其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等,病原学及血清学调查表明,该病在包括我国在内的许多国家都广泛存在,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。本论文主要是对PCV2感染的分子诊断方法、PCV2基因工程疫苗以及不同硒源对PCV2体外复制的影响与机理进行了研究,其目的是为PCV2感染的诊断与防制提供技术支撑和科学依据。主要内容如下:试验1.猪圆环病毒2型、细小病毒及伪狂犬病毒多重PCR方法的建立猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病（PRV）是引起母猪繁殖障碍的重要致病因素。为了解临床上这三种疾病的混合感染并进行鉴别诊断,本文建立了一种同时检测PCV2、PPV、及PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法。根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp（PCV2）、581 bp（PPV）、372bP（PRV gB）及147bp（PRV gE）四条特异性片段。对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出PCV2 10ng、PPV和PRV gB、gE分别为10-6.2、10-3.8、10-5.8TCID50的模板。试验2.猪圆环病毒2型实时定量PCR检测方法的建立利用PCR技术扩增PCV2 ORF2保守区基因107 bp片段并克隆到pMD-19-T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准样品,以10倍梯度稀释的标准样品为模板,进行荧光定量PCR,并绘制标准曲线。建立的实时定量PCR方法,起始模板浓度与Ct值之间呈很好的线性关系,标准曲线斜率为-0.32,相关系数r2=0.997,Ct值在11.9和26.9之间。PCV2能扩出S型荧光曲线,熔解曲线的峰狭窄单一,而PCV1、PPV和PRV均不能扩出。对32份健康猪和32份PMWS可疑猪样品定量检测:健康猪阳性率为44%（14/32）,病毒载量均小于104拷贝·μL-1;PMWS可疑猪阳性率96.8%（31/32）,病毒载量均大于105拷贝·μL-1。试验3.猪圆环病毒2型ORF2基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立根据GenBank中猪群圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计特异性引物,回收PCR产物,将其克隆入pMD18-T载体,再定向克隆到表达载体pET-32a中并转化大肠杆菌Rosetta,进行原核表达。表达产物经His-Bind蛋白纯化试剂盒纯化,平均浓度为1.10mg·mL-1。以1.8μg·mL-1蛋白包被酶标板,建立ELISA检测方法。建立的ELISA方法,与北京世纪元亨公司试剂盒比较,符合率达85%以上。用该方法对常州某猪场36份母猪和156份10-160日龄猪群血清抗体进行了检测,检测结果显示母猪抗体阳性率为81.4%,仔猪抗体阳性率随着日龄的增加,阳性率逐渐降低,后由于受PCV2的感染,阳性率逐渐升高。本文建立的ELISA方法,具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于猪群PCV2抗体的大规模检测。试验4.重组圆环病毒2型Cap蛋白基因的猪细小病毒VP2病毒样粒子的构建与鉴定利用PPV VP2病毒样粒子作为一种抗原转运载体,将猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白第165-200位氨基酸多肽嵌合在猪细小病毒（PPV）VP2 N端,然后重组到腺病毒pAdEasy-1表达系统中,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒（rAd-△Cap-△VP2）。通过空斑纯化,测定其TCID50为1011.5·mL-1。IFA和Western-blotting分析分别可见特异性荧光和大小约为64 kDa的特异性带,表明rAd-△Cap-△VP2在HEK-293细胞中成功地表达了PPV:△VP2和PCV2:△Cap蛋白。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合蛋白具有与全病毒类似的血凝活性。电镜观察嵌合蛋白的粗提物,发现可自行装配成病毒样粒子[PPV:VLP（PCV2）]。试验5.共表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及白细胞介素-2的重组腺病毒的构建与鉴定本研究利用PCR技术将PCV2 Cap蛋白基因和IL-2-Cap融合基因分别克隆入人5型腺病毒穿梭载体（pShuttle-CMV）,与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap和rAd-IL-2-Cap。测定其TCID50为1010.6·mL-1,1010.2·mL-1。利用RT-PCR、IFA、间接ELISA、Western-blotting等方法以及IL-2 ELISA试剂盒分别检测猪圆环病毒2型Cap蛋白和IL-2的体外表达情况,结果证实两基因在腺病毒中获得了表达。该研究为研制PCV2基因工程疫苗奠定了基础。试验6.重组腺病毒免疫特性的研究本研究通过小鼠试验分别观察了重组腺病毒rAd-△Cap-△VP2,rAd-Cap和rAd-Cap-IL-2的免疫特性。取120只6-8周龄的清洁级ICR小鼠,随机分为四组,每组30只,第1组每只小鼠皮下注射1010TCID50重组腺病毒rAd-△Cap-△VP2;第2组每只小鼠皮下注射1010TCID50重组腺病毒rAd-Cap,第3组每只小鼠皮下注射1010TCID50rAd-Cap-IL-2,第4组每只小鼠皮下注射1010TCID50空的腺病毒（wild Ad）,两周后按相同方法加强免疫1次,隔离饲养,并分别在首免后0,14,28,35,42,49和56天,每组取4只小鼠宰杀,采集血清,测定PCV2特异性ELISA抗体和中和抗体;同时无菌取其脾脏,进行淋巴细胞转化试验。结果为前3组免疫小鼠在二免后14天都能检测到PCV2 ELISA杭体,抗体水平随着时间逐渐升高,在二免后35天时ELLSA杭体水平达最高分别为1:10000,1:6000和1:9600,PCV2中和抗体平均滴度分别为1:16,1:10和1:12;同时,第1组免疫小鼠血清中PPV中和抗体达1:20。第4组免疫小鼠在免疫后均未检测到ELISA杭体和中和抗体。Western blotting试验结果表明,免疫小鼠血清中存在PCV2特异性杭体。淋巴细胞转化试验结果为首免后42和56天前3组小鼠Con A/LPS刺激指数不同程度升高。上述结果表明,重组腺病rAd-△Cap-△VP2,rAd-Cap和rAd-Cap-IL-2可以诱导小鼠产生明显的体液免疫和细胞免疫应答,rAd-△Cap-△VP2免疫效果更显著。试验7.不同硒源对猪圆环病毒2型体外感染的影响本试验在已建立的PCV2型实时定量PCR方法检测技术基础上,研究亚硒酸钠、硒蛋氨酸和海藻硒多糖等三种不同硒源对PCV2体外复制的影响。结果表明:三种不同硒源对猪圆环病毒2型在PK-15中的复制呈现不同程度的抑制作用,其中硒蛋氨酸抑制作用显著,在2-16μmol·L-1范围内,浓度愈大,抑制作用愈强,呈剂量依赖性关系。三种不同硒源均能不同程度增强细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活力,其中硒蛋氨酸增强作用显著,提示,硒抗病毒复制的作用主要是通过清除自由基和抗氧化作用来完成的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（Abbreviation）
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 猪圆环病毒研究进展
• 1 病毒的发现
• 2 病毒的理化特性
• 3 病毒的增殖特性
• 4 病毒的分子生物学研究进展
• 5 PCV流行病学
• 6 与PCV2相关疾病
• 7 PCV2的致病机理
• 8 PCV2诊断方法的研究
• 9 PCV2相关疾病的防制
• 10 PCV2相关疾病的疫苗研究
• 11 潜在的公共卫生学意义
• 参考文献
• 第二章 硒的抗病毒作用研究进展
• 1 硒的生物学活性
• 2 硒的存在形式
• 3 硒的抗病毒作用
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第三章 猪圆环病毒2型、细小病毒及伪狂犬病毒多重PCR方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第四章 猪圆环病毒2型实时定量PCR方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第五章 猪圆环病毒2型ORF2基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第六章 重组圆环病毒2型Cap蛋白基因的猪细小病毒VP2蛋白病毒样粒子的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第七章 共表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及白细胞介素-2的重组腺病毒的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第八章 重组腺病毒免疫特性的研究
• 1 材料与试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第九章 不同硒源对猪圆环病毒2型体外感染的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 全文结论
• 本文创新点
• 附录:常用试剂的配制
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录