牛磺酸对肝损伤大鼠氧化/硝基化应激的保护作用

论文摘要

目的：扑热息痛（Acetaminophen, APAP）,又称对乙酰氨基酚,是一种广泛应用的解热镇痛药,长时间大剂量服用扑热息痛、过量服用扑热息痛、服药同时饮酒或引用含酒精的饮料、与其他含有扑热息痛的感冒药及别的药物同时服用等情况下可引起严重的肝损害,甚至导致急性肝功能衰竭。肝性脑病（hepatic encephalopathy, HE）是肝衰竭的一种严重并发症,其死亡率极高,严重危害人类的健康。牛磺酸（Taurine, TAU）作为一种抗氧化剂有着广泛的生物学作用。有研究表明TAU对多种肝损伤有保护作用,因此,本研究拟通过对正常大鼠、APAP肝损伤大鼠、牛磺酸预处理APAP肝损伤大鼠、硫代乙酰胺（thioacetamide, TAA）致HE大鼠、牛磺酸预处理HE大鼠血清各氧化/硝基化指标的检测比较,旨在研究TAU对APAP肝损伤及肝衰竭并发症HE的保护作用及其保护作用机制,为预防APAP肝损伤及肝衰竭并发症提供新的思路和科学依据。研究方法：1对大鼠肝损伤模型的研究1.1 APAP肝损伤大鼠模型的建立及分组雄性Wistar大鼠根据体质量分层,随机分为三组（每组8只）：空白对照组（Ⅰ组）、APAP肝损伤组（Ⅱ组）、牛磺酸预处理APAP肝损伤组（Ⅲ组）。Ⅲ组给予牛磺酸灌胃,100mg/kg/d,连续30天；Ⅰ、Ⅱ组给予1ml/d生理盐水灌胃。30天后,Ⅱ、Ⅲ组一次性给予APAP 750 mg/kg灌胃,复制APAP肝损伤模型。1.2 HE大鼠模型的建立及分组用硫代乙酰胺（Thioacetamide, TAA）建立HE大鼠模型。雄性Wistar大鼠根据体质量分层随机分为三组（每组8只）：空白对照组（I组）、HE模型组（Ⅳ组）、牛磺酸预处理HE模型组（V组）。V组给予牛磺酸灌胃，100 mg/kg/d,连续30天；Ⅰ、Ⅳ组给予1ml/d生理盐水灌胃。30天后,Ⅳ、Ⅴ组腹腔注射TAA,首日剂量为300 mg/kg,随后剂量减半,直至出现HE症状。Ⅰ组每天腹腔注射1ml/d生理盐水。2各种生化指标的测定大鼠断头处死后取血和肝组织,测定血清GSH、TAU、3-NT、ALT、MDA和SOD的含量及肝组织中TAU含量。血清中GSH、3-NT含量采用高效液相色谱-荧光检测法测定；TAU的测定采用高效液相色谱-紫外检测法；赖氏法检测血清中ALT的活力；MDA含量采用硫代巴比妥酸方法检测；黄嘌呤氧化物酶法检测血清中SOD的活力。3组织病理切片的制作及染色各组大鼠处死后取肝组织,制作石蜡切片,进行苏木素-伊红染色观察组织病理改变。结果：1大鼠一般状态及解剖观察Ⅱ组解剖后发现大鼠肝脏普遍充血肿大,呈紫红色,质软。Ⅲ组大鼠肝脏的形状、大小、质地等与Ⅰ组大鼠相似。Ⅳ组大鼠腹腔注射TAA 2 d后,即可出现HEⅠ期或Ⅱ期症状。根据每只大鼠的具体情况减量注射TAA后,在3-5d内,可继续发展至Ⅲ期或Ⅳ期症状。解剖可见肝脏表面黍粒状,体积缩小,呈深紫红色或黑红色,质脆,有大量出血点。V组大鼠给予TAA腹腔注射后发现HE进展速度减缓,未出现或仅出现轻微的HE症状,解剖可见该组大鼠肝脏的形状、大小、质地等与正常大鼠相似。2大鼠生化指标分析2.1Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅰ组血清中ALT、3-NT、GSH、SOD和MDA含量的比较Ⅱ组大鼠各血清指标与Ⅰ组比较,ALT活性显著增高（P<0.05）说明APAP肝损伤模型复制成功；3-NT含量明显高于Ⅰ组（P<0.05）说明酪氨酸硝基化严重；血清GSH和SOD含量显著降低（P<0.05,P<0.05）,MDA含量明显增高（P<0.05）说明体内清除氧自由基的能力下降,脂质过氧化损伤加重。Ⅲ组大鼠与Ⅱ组比较,ALT活性降低（P<0.05）,3-NT含量下降（P<0.05）,GSH和SOD含量均显著增加（P<0.05,P<0.05）,MDA含量明显下降（P<0.05）,而与Ⅰ组比较上述各指标与正常对照组之间差异没有统计学意义,说明牛磺酸对APAP肝损伤有一定的保护作用。2.2Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组大鼠血清及肝组织中TAU含量的比较血清TAU可作为APAP早期肝损伤的标志物,三组大鼠血清TAU含量之间比较发现Ⅱ组血清TAU含量显著升高（P<0.01）,Ⅲ组与Ⅰ组TAU含量比较差异没有统计学意义；三组大鼠肝组织之间TAU含量比较发现Ⅱ组肝组织中TAU含量最低,与其余两组之间差异有统计学意义（P均<0.01）,而Ⅲ组与Ⅰ组之间差异无统计学意义。2.3Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组大鼠血清中TAU含量与3-NT、GSH、SOD和MDA含量之间的相关性分析TAU与各指标之间均有良好的相关性,其中TAU与3-NT和MDA呈正相关（P均<0.01）,与GSH和SOD呈负相关（P均<0.01）。2.4Ⅳ组、Ⅴ组与Ⅰ组血清中ALT、3-NT、GSH、SOD和MDA含量的比较Ⅳ组大鼠血清ALT活性显著高于Ⅰ组（P<0.05）说明Ⅳ组大鼠肝脏受损；3-NT含量与Ⅰ组比较明显增高（P<0.05）说明酪氨酸硝基化严重；血清GSH和SOD含量显著降低（P<0.05,P<0.05）,MDA含量明显增高（P<0.05）说明体内清除氧自由基的能力下降,脂质过氧化损伤加重。Ⅴ组大鼠与Ⅳ组比较,ALT活性降低（P<0.05）,3-NT含量下降（P<0.05）,GSH和SOD含量均显著增加（P<0.05,P<0.05）,MDA含量明显下降（P<0.05）,而与Ⅰ组比较上述各指标与正常对照组之间差异没有统计学意义,说明牛磺酸确实对缓解HE病情进展有一定的保护作用。2.5Ⅳ组、Ⅴ组与Ⅰ组大鼠血清及肝组织中TAU含量的比较Ⅳ组大鼠血清TAU含量显著低于Ⅰ组（P<0.01）,说明Ⅳ组大鼠肝细胞受损。Ⅴ组大鼠与Ⅳ组比较,TAU含量增加（P<0.01）,与Ⅰ组比较差异没有统计学意义。肝组织中TAU含量比较发现Ⅳ组肝组织中TAU含量最低,与其余两组之间差异有统计学意义（P均<0.01）,而Ⅴ组与Ⅰ组之间差异无统计学意义。2.6Ⅰ组、Ⅳ组、Ⅴ组大鼠血清中TAU含量与3-NT、GSH、SOD和MDA含量之间的相关性分析TAU与各指标之间均有良好的相关性,其中TAU与ALT、3-NT和MDA呈负相关（P均<0.01）,与GSH和SOD呈正相关（P均<0.01）。3大鼠病理学观察结果Ⅱ组大鼠可见肝组织结构紊乱,肝细胞不同程度的坏死及大量炎细胞浸润。Ⅳ组大鼠肝小叶结构不清,肝细胞严重坏死溶解或消失,并有大量炎细胞浸润,此外还可见高度水肿细胞,呈毛玻璃样变或气球样变。Ⅲ组、Ⅴ组肝细胞形态与Ⅰ组相比,肝细胞体积略有增大,肝小叶结构未见明显改变。结论：本次实验从生化指标和组织病理学两个角度分析了牛磺酸对肝损伤大鼠的作用。通过比较各氧化/硝基化指标的含量变化得出牛磺酸不仅对APAP肝损伤有一定的保护作用且对肝衰竭并发症HE也有一定的保护作用,这种保护作用机制可能与牛磺酸的抗氧化硝基化有关。此外通过分析体内牛磺酸含量的变化与各氧化/硝基化指标之间的关系说明体内牛磺酸的变化与氧化/硝基化应激有关,从而确定了膳食补充牛磺酸的意义。

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