石杉碱生物合成与代谢调控途径的研究

论文摘要

在代谢工程研究领域中,石杉科植物中的石杉碱甲生物合成与代谢调控的可能途径的建立已然成为该领域的热点。石杉碱甲做为一种强效、低毒且高选择性的中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂,药用价值日益凸显。无论是做为抗老年痴呆症药品,亦或是开发成功能性食品均存在着巨大的市场价值。但由于技术及资源条件的制约,石杉碱甲的获得仍全部依赖于天然石杉科植物全草的提取。因此,了解石杉碱生物合成与代谢可能途径,研究分析这些过程中涉及的关键（酶）基因及其作用的分子机制,对于石杉科植物的有效保护和合理开发利用显得尤为重要。1、石杉碱生物合成途径关键酶基因的扩增体系优化及克隆本论文的目的是建立完善的石杉碱生物合成途径及代谢调控体系。在本实验的研究中,以四种石杉科植物叶片提取的总RNA反转录成的cDNA为模板,应用正交试验,系统的分析了各反应物不同浓度水平对L赖氨酸脱羧酶基因,细胞色素P450,加双氧酶以及甲基转移酶等关键限速酶（基因）PCR扩增结果的影响,并建立了基因扩增优化反应体系。利用基因克隆手段获得并通过比对数据库注释了关键酶基因序列。2、华南马尾杉与有柄马尾杉石杉碱生物合成途径关键酶基因荧光定量Q-PCR分析使用石杉碱甲含量差异较大的华南马尾杉（含量较低）与有柄马尾杉做为试材,通过荧光定量PCR,对比了二者石杉碱生物合成途径中关键酶基因的表达差异。值得注意的是,在华南马尾杉中并未检测到加双氧酶基因的表达,因此假设其编码蛋白质极有可能是石杉碱生物合成途径中一个关键限速酶。另外在有柄马尾杉植体中高表达的基因有L-赖氨酸脱羧酶基因,Cytochrome P450 71A1基因,Cytochrome P450 72A1基因基因。而甲基转移酶基因在两种材料中表达量接近。这些基因编码的蛋白质活跃于石杉碱代谢调控路径中,它们的存在对石杉科植物体内石杉碱含量的积累具有促进作用。3、长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因全长调取及编码蛋白结构分析利用RACE技术获得了长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶共1266 bp基因全长序列,四种碱基的含量分别为：29.5%A；19.4%C；24.4%G；26.7%T；双链的DNA分子大小为780.41 kDa. GOR贝叶斯统计学法分析该序列编码的蛋白质由403个氨基酸组合而成,其中二级结构的存在34.49%的0c-螺旋（Alpha helix）结构,存在19.35%的延伸主链结构（Extended strand）,存在46.15%的随机卷曲（Random coil） 。并且使用Swiss-model预测了蛋白质三级结构,与已有的赖氨酸脱羧酶蛋白质序列进行比对,分析了保守区域及可能相关的功能域。4、石杉碱生物合成及代谢调控可能途径描述石杉碱（石杉碱甲）的生物合成可能途径是由L-赖氨酸经过一些列脱羧,脱氨,加氧,脱H2O后形成的△1-哌啶烯,与来源于乙酸的丙二酸单酰辅酶A结合形成的石榴碱和4PAA；二者经过加合后形成石杉碱前提物质马尾杉碱。闭环后的马尾杉碱便是石松定碱骨架,最后再经过一些列的甲基转换及氧化反应最终形成石杉碱甲。总而言之,石杉碱生物合成途径复杂,参与调控的酶种类也繁多。仍有许多不确定的中间体产物的存在,对于代谢途径及关键酶的研究仍有待深入开展,本论文中对所获得的关于4种石杉科植物这些关键酶基因的分析,属国内外石杉碱代谢途径研究内容前沿。为石杉碱代谢工程研究领域的研究提供了重要的指导价值和全新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 综述石杉碱生物合成与代谢途径研究进展
• 引言
• 1.1 石杉碱甲生源关系及其分子结构
• 1.2 课题研究背景
• 1.3 石杉碱甲的生物合成与代谢调控的关键限速酶（基因）的选择
• 1.3.1 赖氨酸脱羧酶简介
• 1.3.2 细胞色素P450（CYP450）简介
• 1.3.3 甲基转移酶（MTs）简介
• 1.3.4 加双氧酶简介
• 1.4 课题的任务
• 第二章 四种石杉科植物L-赖氨酸脱羧酶基因的克隆及分析
• 引言
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 仪器及设备
• 2.1.4 购买试剂
• 2.1.5 自配标准试剂
• 2.2 试验方法和步骤
• 2.2.1 四种石杉科植物总RNA的提取
• 2.2.1.1 提取RNA的准备工作
• 2.2.1.2 提取RNA步骤
• 2.2.1.3 提取RNA浓度及纯度的测定
• 2.2.2 四种石杉科植物总RNA的反转录成cDNA
• 2.2.3 四种石杉科植物L-lysine decarboxy lase基因扩增
• 2.2.3.1 L-lysine decarboxy lase基因扩增体系反应物水平正交优化
• 2.2.3.2 反应退火温度的优化
• 2.2.3.3 反应程序循环数的优化
• 2.2.3.4 优化体系及退火温度后四种石杉科植物L-赖氨酸脱羧酶基因的扩增
• 2.2.4 割胶纯化回收目的DNA片段操作步骤
• 2.2.5 PCR产物与载体的连接
• 2.2.6 感受态细胞的制备
• 2.2.7 连接反应产物的转化
• 2.2.8 筛选及验证含插入片段的转化子
• 2.2.8.1 包含插入片段质粒的提取
• 2.2.8.2 含插入基因质粒的验证
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 对扩增L-赖氨酸脱羧酶基因优化结果的讨论
• 2.3.1.1 对扩增L-赖氨酸脱羧酶基因反应物正交优化结果的讨论
• 2.3.1.2 对扩增L-赖氨酸脱羧酶基因程序退火温度优化结果的讨论
• 2.3.1.3 对扩增L-赖氨酸脱羧酶基因程序反应循环数优化结果的讨论
• 2.3.2 对感受态细胞制备实验的讨论
• 2.3.3 各材料赖氨酸脱羧酶基因核酸序列的Blast比对结果及系统发生构建
• 2.3.3.1 各材料L-赖氨酸脱羧酶的nucleotide blast下的blastn比对
• 2.3.3.2 各材料赖氨酸脱羧酶基因核酸序列系统发生树分析
• 2.3.4 各材料赖氨酸脱羧酶基因氨基酸序列Blastx比对结果及系统发生构建
• 2.3.4.1 各材料L-赖氨酸脱羧酶的nucleotide blast下的blastx比对
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 四种石杉科植物细胞色素P450基因的克隆及分析
• 引言
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株
• 3.1.3 仪器及设备
• 3.1.4 购买试剂
• 3.1.5 自配标准试剂
• 3.2 试验方法和步骤
• 3.2.1 四种石杉科植物总RNA的提取
• 3.2.2 四种石杉科植物总RNA反转录成cDNA
• 1基因的扩增'>3.2.3 四种石杉科植物细胞色素71A₁基因的扩增
• 1基因的扩增'>3.2.4 四种石杉科植物细胞色素72A₁基因的扩增
• 3.2.5 四种石杉科植物细胞色素90A基因的扩增
• 1基因扩增反应体系退火温度的优化'>3.2.6 细胞色素Cyp450-71A₁基因扩增反应体系退火温度的优化
• 1基因优化反应体系扩增'>3.2.7 细胞色素Cyp450-71A₁基因优化反应体系扩增
• 1基因扩增反应体系退火温度的优化'>3.2.8 细胞色素Cyp450-72A₁基因扩增反应体系退火温度的优化
• 1基因优化反应体系扩增'>3.2.9 细胞色素Cyp450-72A₁基因优化反应体系扩增
• 3.2.10 细胞色素Cyp450-90A基因扩增反应体系退火温度的优化
• 3.2.11 细胞色素Cyp450-90A基因优化反应体系扩增
• 3.2.12 目的DNA片段的割胶纯化回收
• 3.2.13 目的片段与载体的连接
• 3.2.14 感受态细胞的制备
• 3.2.15 连接反应产物的转化
• 3.2.16 筛选及验证含插入片段的转化子
• 3.2.16.1 包含插入片段质粒的提取
• 3.2.16.2 含插入基因质粒的验证
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 各材料细胞色素P450基因核酸序列的Blast比对结果及系统发生构建
• 3.3.1.1 各材料细胞色素P450基因的nucleotide blast下的blastn比对
• 3.3.1.2 各材料细胞色素P450基因基因核酸序列系统发生树分析
• 3.3.2 各材料细胞色素P450氨基酸序列的Blast比对结果及系统发生构建
• 3.3.2.1 各材料细胞色素P450-71A1的blastx比对及系统发生构建
• 3.3.2.2 各材料细胞色素P450-72A1的blastx比对及系统发生构建
• 3.3.2.3 各材料细胞色素P450-90A的blastx比对及系统发生构建
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 四种石杉科植物加双氧酶基因的克隆及分析
• 引言
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 菌株
• 4.1.3 仪器及设备
• 4.1.4 购买试剂
• 4.1.5 自配标准试剂
• 4.2 试验方法和步骤
• 4.2.1 四种石杉科植物总RNA的提取
• 4.2.2 四种石杉科植物总RNA的反转录成cDNA
• 4.2.3 加双氧酶基因的扩增正交优化
• 4.2.4 加双氧酶基因扩增反应体系退火温度的优化
• 4.2.5 加双氧酶基因优化反应体系扩增
• 4.2.6 目的DNA片段的割胶纯化回收
• 4.2.7 目的片段与载体的连接
• 4.2.8 感受态细胞的制备
• 4.2.9 连接反应产物的转化
• 4.2.10 筛选及验证含插入片段的转化子
• 4.2.10.1 包含插入片段质粒的提取
• 4.2.10.2 含插入基因质粒的验证
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 各材料加双氧酶序列的Blast比对及系统发生的构建
• 4.3.2 对加双氧酶序列的比对结果的讨论
• 第五章 四种石杉科植物甲基转移酶基因的克隆及分析
• 引言
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 菌株
• 5.1.3 仪器及设备
• 5.1.4 购买试剂
• 5.1.5 自配标准试剂
• 5.2 试验方法和步骤
• 5.2.1 四种石杉科植物总RNA的提取
• 5.2.2 四种石杉科植物总RNA的反转录成cDNA
• 5.2.3 四种石杉科植物甲基转移酶基因的扩增
• 5.2.4 甲基转移酶基因扩增反应体系退火温度的优化
• 5.2.5 甲基转移酶基因优化反应体系扩增
• 5.2.6 目的DNA片段的割胶纯化回收
• 5.2.7 目的片段与载体的连接
• 5.2.8 感受态细胞的制备
• 5.2.9 连接反应产物的转化
• 5.2.10 筛选及验证含插入片段的转化子
• 5.2.10.1 包含插入片段质粒的提取
• 5.2.10.2 含插入基因质粒的验证
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 对扩增甲基转移酶基因优化结果的讨论
• 5.3.2 各材料甲基转移酶基因序列的Blast比对结果及系统发生构建
• 5.3.2.1 各材料甲基转移酶基因的nucleotide blast下的blastn比对
• 5.3.2.2 各材料甲基转移酶的blastx比对
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 华南马尾杉及有柄马尾杉石杉碱生物合成途径中关键酶基因的荧光定量分析
• 引言
• 6.1 试验材料
• 6.1.1 植物材料
• 6.1.2 仪器设备及耗材
• 6.1.3 购买试剂
• 6.1.4 自配标准试剂
• 6.2 试验方法和步骤
• 6.2.1 华南马尾杉与有柄马尾杉总RNA的提取
• 6.2.1.1 提取RNA的准备工作
• 6.2.1.2 提取RNA步骤
• 6.2.1.3 提取RNA浓度及纯度的测定
• 6.2.2 华南马尾杉与有柄马尾杉总RNA的反转录成cDNA
• 6.2.3 荧光定量PCR引物设计
• 6.2.3.1 关键酶基因引物设计原则
• 6.2.3.2 内参基因引物的设计
• 6.2.3.3 关键酶基因引物的设计
• 6.2.4 华南马尾杉与有柄马尾杉关键酶基因的荧光定量分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 荧光定量PCR结果分析
• 6.3.1.1 L-赖氨酸脱羧酶基因荧光定量PCR结果分析
• 6.3.1.2 Cytochrome P450 71A1基因荧光定量PCR结果分析
• 6.3.1.3 Cytochrome P450 72A1基因荧光定量PCR结果分析
• 6.3.1.4 加双氧酶基因荧光定量PCR结果分析
• 6.3.1.5 甲基转移酶基因荧光定量PCR结果分析
• 6.3.2 荧光定量PCR结果数值计算及分析
• 6.4 小结与讨论
• 第七章 长柄石杉LDB基因全长的调取
• 引言
• 7.1 试验材料
• 7.1.1 植物材料
• 7.1.2 菌株
• 7.1.3 仪器设备及耗材
• 7.1.4 购买试剂
• 7.1.5 自配标准试剂
• 7.2 试验方法和步骤
• 7.2.1 引物合成
• 7.2.2 L-赖氨酸脱羧酶基因5’race
• 7.2.2.1 总RNA提取
• 7.2.2.2 cDNA第一条链的合成
• 7.2.2.3 TDT加尾反应
• 7.2.2.4 巢式PCR反应
• 7.2.3 L-赖氨酸脱羧酶基因3’race
• 7.2.3.1 总RNA提取
• 7.2.3.2 cDNA第一条链的合成
• 7.2.3.3 巢式PCR反应
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 长柄石杉LDB基因序列全长
• 7.3.2 长柄石杉LDB氨基酸序列全长
• 7.3.3 二级结构分析
• 7.3.4 三级结构分析
• 7.3.4.1 从63至242位氨基酸评价结果
• 7.3.4.2 从29至240位氨基酸评价结果
• 第八章 结论与展望
• 引言
• 8.1 石杉碱甲的生物合成及代谢调控可能途径描述
• 8.2 展望
• 8.3 本文创新点
• 8.4 需继续深入研究的课题项目
• 8.5 研究生期间参与的基金研究项目及发表的论文
• 参考文献
• 附录
• 致谢