牛瘤胃未培养微生物纤维素酶基因的克隆、鉴定及表达

论文题目: 牛瘤胃未培养微生物纤维素酶基因的克隆、鉴定及表达

论文类型: 硕士论文

论文专业: 微生物学

作者: 赵广存

导师: 冯家勋

关键词: 牛瘤胃,未培养微生物,宏基因组文库,葡萄糖苷酶,纤维素酶,木聚糖酶,克隆,表达

文献来源: 广西大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本研究通过构建牛瘤胃未培养微生物的宏基因组文库,共获得12000个克隆,文库外源DNA总容量为4.2×10~8bp,筛选得到十个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆和十个表达β-1,4-内切葡聚糖酶活性的克隆,而且在十个表达β-1,4-内切葡聚糖酶活性的克隆中pGXN1035和pGXN1067两个克隆兼表达木聚糖酶活性。选择表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆pGXN1009和表达β-1,4-内切葡聚糖酶活性兼表达木聚糖酶活性的克隆pGXN1035和pGXN1067作为进一步研究的对象。通过亚克隆及测序得到三个基因umbg13A、umce15C和umce15D。 umbg13A基因全长为1956bp,其编码产物是由651个氨基酸组成的蛋白,蛋白质预计的分子质量为70133Da。其编码产物与一个来源于小鼠大肠未培养细菌的β-葡萄糖苷酶的一致性为63%、相似性为79%。Umbg13A包含一个家族3糖基水解酶功能域和一个家族3C糖基水解酶功能域。遗传进化分析推测umbg13A基因可能是来自牛瘤胃微生物噬纤维菌属的一个种。 umce15C基因全长为1314bp,其编码产物是由437个氨基酸组成的、分子质量预计为48,675Da。Umce15C蛋白与栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)的木聚糖酶的一致性为45%、相似性为62%,与布赖恩特普雷沃氏菌(Prevotella bryantii)的β-1,4-内切葡聚糖酶的一致性为38%、相似性为55%,Umce15C蛋白N端的第2-221个氨基酸是糖基水解酶家族5功能域。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

目录

第一章 前言

1.1 未培养微生物

1.2 宏基因组文库的构建和应用

1.3 环境总DNA的提取与纯化

1.3.1 DNA的提取

1.3.2 DNA的纯化

1.4 瘤胃微生物及纤维素分解菌

1.4.1 瘤胃真菌

1.4.2 瘤胃细菌

1.4.3 瘤胃中原生动物

1.5 瘤胃微生物产生的纤维素酶

1.6 纤维素酶的研究进展

1.6.1 纤维素酶的结构

1.6.2 催化功能域

1.6.3 碳水化合物结合功能域

1.6.4 连接桥(Linker)

1.6.5 纤维素酶的作用机理

1.7 本研究的目的

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细菌菌株和质粒

2.1.2 菌种保存

2.1.3 培养基、培养条件和抗生素

2.1.4 常规溶液、缓冲液

2.2 方法

2.2.1 质粒提取

2.2.3 总DNA的部分消化

2.2.4 电透析洗脱法回收DNA片段

2.2.5 DNA的转化

2.2.6 SDS-PAGE蛋白质电泳

2.2.7 牛瘤胃未培养细菌总DNA的提取及纯化

2.2.8 牛瘤胃未培养细菌Cosmid文库的构建

2.2.9 文库的筛选

2.2.10 PCR扩增

2.2.11 基因的表达

2.2.12 CMCase酶活测定

2.2.13 系统进化树进化分析

第三章 结果与分析

3.1 牛瘤胃未培养细菌总DNA的提取及纯化

3.2 文库的构建

3.3 文库的筛选

3.3.1 表达CMCase活性克隆的筛选

3.3.2 表达β-葡萄糖苷酶活性克隆的筛选

3.4 β-葡萄糖苷酶基因umbg13A克隆、鉴定与分析

3.4.1 pGXN1009亚克隆

3.4.2 umbg13A基因测序及分析

3.4.3 Umbg13A蛋白的系统进化分析

3.5 Umce15C基因的克隆、鉴定与分析

3.5.1 pGXN1035的亚克隆

3.5.2 pGXN1035的测序及分析

3.6 Umce15D基因的克隆、鉴定与分析

3.6.1 pGXN1067的亚克隆

3.6.2 umce15D基因的测序及分析

3.7 Umce15C蛋白和Umce15D蛋白的比较

3.8 Umce15C蛋白和Umce15D蛋白的遗传进化分析

3.9 Umce15D蛋白的表达和酶学活性的初步测定

2.9.1 Umce15D的表达

3.9.2 Umce15D蛋白内切β-1.4-葡聚糖酶活性的初步测定

第四章 总结与讨论

4.1 牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建及筛选

4.2 纤维素酶基因的鉴定及表达

参考文献

致谢

附录1：本论文中所用到的质粒多克隆位点图

附录2：参与的科研、取得的成果和发表的文章

发布时间: 2005-07-21

参考文献

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