狐貉源犬瘟热病毒分离株H、N基因序列分析及真核表达载体的构建

论文摘要

犬瘟热对于毛皮动物养殖业来说，是危害最为严重的传染病之一，并且一直没有得到很好地控制，常导致60％-100％的死亡率，给养殖场（户）造成了近乎毁灭性的打击；特别是近几年呈现了已免疫的毛皮动物种群仍然大规模发病的流行特点，为犬瘟热的有效防治带了新的挑战。2004-2006年从黑龙江各地毛皮动物养殖场、个体养殖户共收集到接种过犬瘟热疫苗的发病狐、貉送检样品共计48份，通过临床病理剖检和RT-PCR方法对其进行了检测，结果表明85％的送检样品均为犬瘟热感染，表明目前犬瘟热仍然是危害狐、貉等毛皮动物种群的最重要的传染病。根据流行病学资料的调查，笔者从来自于发病率和死亡率都很高的种群的送检样品中选取了三份初检CDV阳性样品，从中分离到MS01、SC01、ZD01三株CDV，用RT-PCR的方法对其血凝素蛋白（H）基因、核蛋白（N）基因进行扩增，并将其进行克隆和测序。测序结果表明3个CDV分离株H基因阅读框架全长均为1824bp，编码607个氨基酸，N基因阅读框架全长均为1572bp，编码523个氨基酸。利用DNAstar的MegAlign生物软件，将三个病毒分离株与Genbank数据库中现有的CDV毒株的H和N基因序列及推导出的氨基酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析。结果发现三个病毒分离株的H和N基因与疫苗株差异较大，与野毒株同源性较高，并表现出一定的地理位置相关性，提示这可能是造成目前已免疫动物仍然发生犬瘟热流行的重要原因之一。笔者进而以代表性较强的CDV MS01株为材料，将其H和N基因插入真核表达载体pcDNA3.1（+），构建了pcDNA-H、pcDNA-N真核表达质粒，并通过酶切和PCR在DNA水平上鉴定出重组质粒的成功构建，为针对毛皮动物犬瘟热病毒感染的DNA疫苗的研制奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 犬瘟热病原概况
• 1.2.2 犬瘟热病毒的分子生物学研究概况
• 1.2.3 犬瘟热的诊断和预防
• 1.2.4 犬瘟热的流行特点和趋势
• 1.2.5 重要的公共卫生意义
• 1.3 本研究课题的来源及主要内容
• 2 黑龙江省各地区毛皮动物犬瘟热病毒感染状况的初步调查
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 样品的收集与采集
• 2.1.2 主要试剂和仪器设备
• 2.1.3 犬瘟热的临床病理剖检
• 2.1.4 用RT-PCR方法在病料中检测犬瘟热病毒
• 2.2 结果
• 2.2.1 犬瘟热的临床病理剖检
• 2.2.2 用RT-PCR方法在病料中检测犬瘟热病毒的结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 犬瘟热发病原因
• 2.3.2 用RT-PCR方法在病料中检测犬瘟热病毒
• 2.4 本章小结
• 3 狐貉源犬瘟热病毒H、N基因的克隆与序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 毒株来源
• 3.1.2 主要试剂和仪器设备
• 3.1.3 H、N基因的克隆
• 3.1.4 序列测定
• 3.1.5 序列比较分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 H、N基因的RT-PCR
• 3.2.2 三株CDV H、N基因的亚克隆和阳性重组质粒的鉴定
• 3.2.3 三株CDV H、N基因的阳性重组质粒的测序结果
• 3.2.4 CDV H基因的序列分析
• 3.2.5 CDV H基因和蛋白系统进化树分析
• 3.2.6 CDV N基因的序列分析
• 3.2.7 CDV N基因和蛋白系统进化树分析
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 4 CDV MS01分离株H、N基因真核表达载体的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 病毒株
• 4.1.2 主要试剂和仪器设备
• 4.1.3 引物的设计与合成
• 4.1.4 CDV MS01株H、N基因的克隆
• 4.1.5 H、N基因真核表达载体的构建
• 4.1.6 重组真核表达质粒的鉴定
• 4.1.7 犬瘟热H、N基因DNA疫苗质粒的大量制备及纯化
• 4.2 结果
• 4.2.1 CDV MS01株H、N基因的扩增
• 4.2.2 CDV MS01株H、N基因扩增产物的双酶切和回收结果
• 4.2.3 载体质粒pcDNA3.1（+）的双酶切和回收结果
• 4.2.4 重组真核表达质粒的鉴定
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢