论文摘要
目的:构建日本血吸虫组织蛋白酶B（Sjcb2）原核表达载体pWR450-1/sjcb2并表达;构建真核表达载体pcDNA3.1（+）/sjcb2,转染HeLa细胞,并将pcDNA3.1（+）/sjcb2直接肌注BALB/c小鼠,观察其所诱导的体液免疫和细胞免疫应答水平,初步研究该核酸疫苗对BALB/c小鼠诱导的免疫保护性作用,为研制新型抗日本血吸虫感染核酸疫苗提供实验依据。 方法:用PRIMER5.0引物设计软件自行设计引物,PCR法扩增sjcb2基因片段,将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白斑筛选、双酶切分析和PCR鉴定后,亚克隆入pWR450-1原核表达载体及pcDNA3.1（+）真核表达载体中,经抗生素（氨苄青霉素）筛选、双酶切鉴定、PCR鉴定及测序鉴定后,将构建的pWR450-1/Sjcb2重组原核表达载体转化大肠杆菌后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting鉴定表达情况。构建的pcDNA3.1（+）/sjcb2重组质粒电穿孔转染HeLa细胞,免疫细胞化学法观察其在真核细胞中的表达情况;将核酸疫苗pcDNA3.1（+）/Sjcb2注射到BALB/c小鼠后腿股四头肌肌肉组织中,每2周免疫一次,共免疫3次。末次免疫后2周,用日本血吸虫尾蚴攻击感染BALR/c小鼠。PCR及免疫组化法分析Sjcb2基因在小鼠体内的稳定性及表达情况;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖反应;ELISA双抗体夹心法测定攻击感染前后小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的水平;琼脂双向扩散试验测定小鼠血清中Sjcb2抗体水平;攻击感染42天后剖杀小鼠,计算小鼠所荷成虫对数及肝脏所荷虫卵数。 结果:成功构建pWR450-1/Sjcb2重组原核表达载体,并在E.coli DH5α中表达出一分子量约为86KDa的重组融合蛋白。 成功构建pcDNA3.1（+）/sjcb2真核表达重组体,电穿孔转染HeLa细胞,免疫细胞化学法表明Sjcb2能在HeLa细胞胞浆中表达。将核酸疫苗pcDNA3.1（+）/Sjcb2
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