美国白蛾核型多角体病毒蛋白质检测方法的建立及应用

论文摘要

试验以美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cunea Nucleopolyhedrovirus,HcNPV）为研究对象,从其病毒的提取及纯化、形态特征、多角体蛋白的分析比较、间接ELISA法的建立以及对美国白蛾核型多角体和其他几种核型多角体及不相关物质的实际检测等进行了研究,研究内容与结果如下:差速离心法及蔗糖密度梯度离心法对美国白蛾核型多角体病毒进行了提取和纯化,通过电子显微镜对其形态进行了观察,发现美国白蛾核型多角体为不规则的多面体,直径约0.5～2μm;其包埋类型多数为多粒包埋型,少数为单粒包埋型,包埋的粒子数目不固定,一般为几个到十几个。对美国白蛾核型多角体病毒进行了3龄幼虫的毒力测试,利用SPSS软件分析病毒的半致死浓度LC50为1.94×105 PIBs·mL-1。同时实验表明,在美国白蛾核型多角体病毒液浓度达到5×106 PIBs·mL-1时,其幼虫的死亡率已经高达95%,该浓度可以作为林间喷洒浓度。通过作图显示,剂量对数值与死亡机率值呈线性关系。对美国白蛾核型多角体病毒包涵体蛋白和其他4种昆虫核型多角体病毒的包涵体蛋白进行了SDS-PAGE电泳比较。通过比较,发现多数都有主带32 KD蛋白和次带64 KD蛋白,次带64 KD蛋白可能是主带32 KD蛋白的二聚体结构,并且发现美国白蛾核型多角体病毒包涵体蛋白在18 KD处相对其它几种昆虫的核型多角体包涵体蛋白有一条比较明显的特异性蛋白条带。建立了间接ELISA法检测美国白蛾核型多角体的方法,通过该方法,美国白蛾核型多角体病毒的最小检出量为1.697μg·mL-1,对应的美国白蛾核型多角体病毒颗粒含量为1.56×105 PIBs·mL-1。确定间接ELISA法检测时,兔抗美国白蛾核型多角体病毒抗血清最佳工作浓度为1:320,美国白蛾核型多角体病毒液最佳稀释度为1:200（即美国白蛾病毒含量为2.5×106 PIBs·mL-1）。同时,将其浓度对数值与OD490值作图,得知在浓度3.12×105～2.5×107 PIBs·mL-1范围内呈线性关系,可以作为标准曲线对核型多角体的浓度进行计算。通过建立的间接ELISA法,对其他几种昆虫核型多角体病毒以及不相关蛋白的测定,以及检测健康虫和感病虫的血淋巴,证明美国白蛾核型多角体抗体具有较高的特异性,可进行实际应用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 研究背景与意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 昆虫病毒学研究概况
• 1.2.2 杆状病毒的结构与功能
• 1.2.3 美国白蛾及其核型多角体病毒研究概况
• 1.2.4 酶联免疫的国内外研究进展
• 1.3 研究目的、主要内容及技术路线
• 1.3.1 研究目的
• 1.3.2 主要内容
• 1.3.3 技术路线
• 第二章 试验材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 昆虫材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 试验器材及仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 美国白蛾核型多角体病毒病毒提取与纯化
• 2.2.2 美国白蛾核型多角体病毒的形态学观察
• 2.2.3 美国白蛾核型多角体病毒病毒的毒力测试
• 2.2.4 美国白蛾核型多角体病毒多角体蛋白的提取
• 2.2.5 美国白蛾及其他4 种核型多角体病毒多角体蛋白的SDS—PAGE 电泳..
• 2.2.6 美国白蛾核型多角体病毒抗血清的制备
• 2.2.7 美国白蛾核型多角体病毒的间接ELISA 法检测
• 2.2.8 间接ELISA 法测定美国白蛾核型多角体病毒的实际应用
• 第三章 试验结果与分析
• 3.1 美国白蛾核型多角体
• 3.2 美国白蛾核型多角体病毒的电镜观察
• 3.3 美国白蛾核型多角体病毒的毒力测试结果
• 3.4 美国白蛾核型多角体病毒病毒包涵体蛋白
• 3.5 美国白蛾核型多角体病毒病毒包涵体蛋白与其他4 种SDS—PAGE 电泳比较.
• 3.6 美国白蛾核型多角体病毒的间接ELISA 法检测结果
• 3.7 间接ELISA 法测定美国白蛾核型多角体病毒的实际应用比较
• 3.8 对美国白蛾健康虫体和感病虫体血淋液的检测
• 第四章 讨论
• 4.1 蔗糖法提纯HcNPV
• 4.2 HcNPV 的形态学观察
• 4.3 HcNPV 蛋白的SDS-PAGE 分析讨论
• 4.4 HcNPV 的间接ELISA 法检测
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介