罗氏沼虾咽侧体抑制素基因及其天然反义RNA的分子特征与表达分析

论文摘要

咽侧体抑制素是无脊椎动物中最大的神经肽家族之一，在昆虫中它不仅可以抑制保幼激素的合成与释放，还可以通过调节肌肉的收缩影响其它生理过程。然而在除昆虫以外的其它任何物种中，均没有编码咽侧体抑制素基因的报道，更没有其基因表达时空特征以及相关调控因子的研究。 本研究以具有重要经济价值的淡水虾类—罗氏沼虾（Macrobrachim rosenbergii）作为研究对象，从其中枢神经系统的cDNA文库中分别克隆到罗氏沼虾咽侧体抑制素基因（命名为Macro-AST A）及其内源性天然反义基因（命名为asMacro-AST A）。Macro-AST A全长为2，855 bp，编码一个由701个氨基酸残基组成的咽侧体抑制素前体多肽。如果所有的碱性蛋白酶切位点被识别剪切，那么这个前体多肽最少可以形成35个，29种不同类型的咽侧体抑制素。asMacro-ASTA全长为2，182 bp，包含的最大开放阅读框仅由159 bp组成。Blast分析发现没有其它已知的基因或蛋白与asMacro-AST A具有同源性。但是，在其序列内部（882 bp到1，725 bp）存在一段与Macro-ASTA基因3′末端完全反向互补的序列。这是首次在甲壳动物中发现编码咽侧体抑制素的基因，同时，也是在所有已发现的咽侧体抑制素基因中首次检测到它们存在天然反义基因。 另外，运用半定量RT-PCR和Southern blotting analysis等分子生物学手段分析了Macro-AST A在罗氏沼虾体内的分布情况和发育表达特征，以及在基因组上的拷贝数。结果表明：Macro-AST A在神经组织如脑、胸部神经节、腹部神经节和内分泌组织如肠中表达，而在其它组织如心脏、腮、卵巢、肝脏或肌肉组织中均不表达；雌性罗氏沼虾从未成熟向成熟阶段发育的过程中，不论是在胸部神经节还是在脑组织中Macro-ASTA的表达量都呈现增加趋势，但是在蜕皮后一天表达量下降，而且在脑组织中，这种增加与下降的趋势更加明显；在雄性罗氏沼虾的附肢掌节从白色向黄色转变的过程中，Macro-AST A的表达量在胸部神经节中呈上升趋势，在脑组织中呈下降趋势；当雄虾附肢掌节变蓝时，Macro-AST A的表达量在胸部神经节中迅速下降，在脑组织中基本无表达；Macro-AST A在罗氏沼虾的基因组中以单拷贝

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 1.甲壳动物神经多肽研究概述
• 1.1 甲壳动物高血糖激素肽家族
• 1.2 促色素细胞素
• 1.3 心兴奋肽相关肽
• 1.4 速激肽相关肽
• 1.5 肠动肽
• 1.6 甲壳动物心激肽
• 2.咽侧体抑制素
• 2.1 咽侧体抑制素的分类与特征
• 2.2 昆虫中的咽侧体抑制素
• 2.3 甲壳动物中的咽侧体抑制素
• 3.天然反义RNA
• 3.1 天然反义RNA的概念
• 3.2 顺式天然反义RNA
• 3.3 反式天然反义RNA
• 3.4 天然反义RNA在真核生物基因表达调控中的机制
• 参考文献
• 第二部分 研究内容
• 第一章 罗氏沼虾咽侧体抑制素基因及其天然反义RNA的分子克隆
• 1.引言
• 2.材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3.方法
• 3.1 罗氏沼虾神经组织的取材
• 3.2 中枢神经系统总RNA的抽提
• 3.3 mRNA的分离纯化
• 3.4 cDNA文库的构建与滴度检测
• 3.5 简并引物的设计与cDNA文库的PCR筛选
• 3.6 文库筛选探针的制备
• 4.结果
• 4.1 cDNA文库的构建与罗氏沼虾咽侧体抑制素基因片段的获得
• 4.2 罗氏沼虾咽侧体抑制素基因及其天然反义RNA的分子克隆与特征分析
• 5.讨论
• 参考文献
• 第二章 罗氏沼虾咽侧体抑制素基因的表达特征与基因组结构分析
• 1.引言
• 2.材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3.方法
• 3.1 Northern blotting分析
• 3.2 半定量RT-PCR（semi-quantitative RT-PCR）
• 3.3 Macro-AST A的基因组拷贝数分析
• 4.结果
• 4.1 Macro-AST A的组织表达特异性研究
• 4.2 Macro-AST A在发育过程中的表达特异性研究
• 4.3 Macro-AST A的基因组拷贝数分析
• 5.讨论
• 参考文献
• 第三章 罗氏沼虾咽侧体抑制素基因与其天然反义RNA互作的初步研究
• 1.引言
• 2.材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3.方法
• 3.1 Northern blotting分析
• 3.2 引物特异性反转录PCR（primer-specific RT-PCR）
• 3.3 RNA-RNA二聚体的检测
• 4.结果
• 4.1 asMacro-ASTA在罗氏沼虾中的组织分布
• 4.2 asMacro-ASTA基因的引物特异性RT-PCR
• 4.3 RNA-RNA二聚体的检测
• 5.讨论
• 参考文献
• 第四章 结论与展望
• 1.结论
• 2.有待进一步开展的工作
• 第三部分 本研究的创新点
• 第四部分 附录
• 附录一 常用试剂配制一览表
• 附录二 攻读博士学位期间发表、投稿论文
• 致谢
• 附图