罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及重组表面免疫原性蛋白His-Sip的免疫效果初步研究

论文摘要

罗非鱼（Tilapia）隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科（Cichlidae）、罗非鱼属（亦称丽鲷科,丽鲷属）。由于罗非鱼具有杂食性、生长快、繁殖力强、适应性广等优点,目前已成为世界性主要养殖鱼类,中国罗非鱼养殖产量占世界的一半以上。抗病力强是罗非鱼被广泛养殖的主要因素之一。但随着世界各地罗非鱼链球菌病的出现,一直以来认为罗非鱼具有强抗病力、不易患病的观点已受到挑战。最近几年我国也有罗非鱼链球菌病的发生,但仅局限于小范围内流行,所导致的死亡率为20-30%。2009年广东与海南省多个罗非鱼主养区发生暴发病,与往年的发病情况比较,本次病害发生的范围较广、罗非鱼受感染率与死亡率均较高,个别发病率超过50%,发病鱼死亡率超过95%。本实验室研究人员赶赴广东与海南省各罗非鱼主养区,采集发病鱼样本,开展了相关研究。本论文内容包括病原菌的分离与鉴定、药物敏感性试验;双重PCR法鉴定无乳链球菌与海豚链球菌;致病菌分子血清型的鉴定;重组表面免疫原性蛋白Sip的制备及免疫原性分析等。研究结果对罗非鱼链球菌病的有效防控、促进罗非鱼养殖业的健康发展具有重要意义。1病原菌的分离与鉴定及药物敏感性分析从各地患病罗非鱼体表病灶上共分离纯化了二十多株优势菌,回归感染试验显示这些分离菌株都能感染罗非鱼且具有强毒力。挑取其中毒力最强的7株,进行形态特征和主要理化特性分析,初步鉴定为无乳链球菌（Streptococus agalactiae）。进一步对其进行分子鉴定,PCR扩增16S rRNA基因和无乳链球菌特有GBS-specific gene cfb （CAMP factor）基因的全长序列,BLAST分析显示所有菌株的16S rRNA基因与GenBank上登录的无乳链球菌的相应序列高度同源（> 99.8%）,各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源性（≥99.9%-100%）。各菌株间cfb基因序列高度同源（100%）,与已知无乳链球菌的相应序列也具有高度同源性（≥99.0%）。综合生理生化与分子鉴定结果,可判定所分离的菌株为无乳链球菌。药敏试验显示,29种抗生素中13种为敏感,7种为不敏感,9种存在菌株间的差异。2双重PCR快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌方法的建立无乳链球菌和海豚链球菌是鱼类链球菌病常见的二种病原菌,所引发的病症相似,难于根据病症直接判断病原菌。本研究根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16S rRNA基因序列设计合成两对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法。用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌后可分别获得474bp和296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等其它常见鱼病原菌则无特异性片段产生。该方法具较高的灵敏度,可检测到基因组含量分别为3.2×10-3ng·μL-1的无乳链球菌和3.0×10-2 ng·μL-1的海豚链球菌。该法的建立可实现对无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,为病害的有效控制提供依据。3无乳链球菌分离株分子血清型的分型采用多重PCR与单核苷酸序列多态性（SNP）分析方法,检测了无乳链球菌荚膜多糖抗原基因CPS、Alpha C蛋白基因ACP,确定了2009、2010年广东与海南各罗非鱼主养区分离到的病原菌的分子血清型,并结合多位点序列分型（MLST）分子分型方法进行进一步的分析,发现这些分离株均属ST-7型,该型在GBS数据库中未发现相应的血清型,说明这些分离株具有不同于已知的人类或动物GBS的分子特性,研究结果为进一步的流行病学研究与疫苗制备提供重要的参考。4无乳链球菌表面免疫原性蛋白Sip的基因克隆、表达及免疫原性分析表面免疫原性蛋白（Surface Immunogenic Protein,Sip）是B群链球菌（Group B streptococcus, GBS）的一种表面蛋白,在GBS多种血清型的菌株中均有表达。本研究采用PCR方法从本实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌广东株的基因组DNA中扩增出Sip基因,构建原核表达载体pColdII-Sip,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 （DE3）菌株。经诱导表达、SDS-Page电泳检测显示重组蛋白主要以可溶形式表达。重组蛋白用亲和层析的方法纯化,蛋白纯度达98%。纯化后的重组蛋白免疫罗非鱼（Oreochromis niloticus, GIFT strain）以分析其免疫原性。受免鱼免疫14d后进行人工攻毒试验,免疫组的相对保护率为70%87%。酶联免疫吸附试验（Elisa）显示受免鱼血清对重组蛋白产生了较好的免疫应答,抗体滴度可达约1:128 000。本研究结果显示重组蛋白Sip具有较强的免疫原性和保护作用,Sip基因可作为罗非鱼链球菌基因工程亚单位疫苗的候选基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 无乳链球菌的特征
• 1.1 无乳链球菌的分类地位和生化特性
• 1.2 无乳链球菌对于鱼类的致病性
• 1.3 无乳链球菌的检测及鉴定
• 1.4 无乳链球菌表面蛋白研究进展
• 2 链球菌病对鱼类的危害
• 3 鱼用疫苗研究现状
• 3.1 常规疫苗
• 3.2 基因工程疫苗
• 4 鱼类链球菌疫苗的免疫预防研究
• 5 本研究目的与意义
• 第一章 无乳链球菌的分离、鉴定及药敏试验分析
• 1 材料与方法
• 1.1 患病罗非鱼和实验动物
• 1.2 克隆质粒和菌株
• 1.3 培养基
• 1.4 常用试剂及试剂盒
• 1.5 溶液和缓冲液
• 1.6 方法
• 2 结果
• 2.1 病原菌人工感染
• 2.2 病鱼组织除菌液人工感染实验
• 2.3 病原菌与菌落形态
• 2.4 生理生化特性
• 2.5 16SrRNA 与cfb 基因及系统发育分析
• 2.6 药敏试验
• 3 讨论
• 第二章 双重PCR 快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 双重PCR 检测无乳链球菌和海豚链球菌的特异性
• 2.2 双重PCR 检测无乳链球菌和海豚链球菌的敏感性
• 2.3 临床样品的双重PCR 检测结果
• 3 结果与讨论
• 第三章 无乳链球菌分离株分子血清型的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株及载体
• 1.2 常用试剂及试剂盒
• 1.3 分子分型（Molecular serotyping）
• 1.4 多位点序列分型（multi-locus sequence typing ,MLST）
• 2 结果
• 2.1 无乳链球菌血清型分析
• 2.2 无乳链球菌序列多态性分析
• 3 结果与讨论
• 第四章 无乳链球菌表面免疫原性蛋白Sip 基因的克隆、表达及免疫原性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒和菌种及实验动物
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 溶液和缓冲液
• 1.4 方法
• 2 结果
• 2.1 Sip 基因的扩增，克隆测序产物
• 2.2 基因Sip 的PCR 鉴定与测序
• 2.3 Sip 基因的抗原性分析
• 2.4 重组白诱导表达、SDS–PAGE 分析与纯化
• 2.5 免疫印记分析
• 2.6 外膜蛋白Sip 对罗非鱼的免疫保护作用
• 2.7 Elisa 检测罗非鱼血清抗体
• 2.8 灭活疫苗对罗非鱼的免疫保护作用
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 附录A 缩略词表
• 附录B 表达质粒pCodII 载体图谱
• 附录C 在读期间参与发表的文章及学术交流
• 致谢