论文摘要
【背景】类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种高度致残性自身免疫性疾病,在我国RA的发病率约0.34%,患病总人数达500万,每年直接用于RA的治疗费用和因劳动力丧失带来的间接经济损失很大。近年的研究发现间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）具有免疫调节作用,同时MSCs可迁移到损伤和炎症部位,在局部微环境作用下分化为外胚层、中胚层细胞,甚至内胚层细胞,参与组织重建和修复,这些为RA患者的免疫抑制治疗,以及受损关节的修复带来了新的希望。【目的】通过对RA动物模型胶原诱导关节炎（CIA）大鼠的实验研究,观察异基因MSCs移植对（早期、晚期）CIA大鼠免疫细胞和分子的免疫学作用,并探讨其在体内发挥免疫调节作用的机制;观察异基因MSCs移植在CIA大鼠免疫器官和关节炎症部位的归巢和分布,并探讨其修复损伤关节可能的机制。【方法】第一部分:采用密度梯度离心结合贴壁培养法体外分离、培养大鼠MSCs,细胞表型鉴定。第二部分:（1）弗氏完全佐剂+Ⅱ型胶原初次免疫雌性Wistar大鼠,14d弗氏完全佐剂+Ⅱ型胶原第2次免疫动物,建立CIA大鼠模型。（2）大鼠分为早期治疗组（佐剂初次诱导时治疗组）和晚期治疗组（再次诱导时治疗组）,同时设立正常组和早、晚期CIA对照组,每组8只。（3）MSCs移植均采用尾静脉注射,每只大鼠移植的细胞数为1×107个/Kg;对照组以同样方法给予等容量的生理盐水。（4）观察42天不同分组大鼠的关节症状及进行关节炎指数和肿胀度测定。（5）MSCs移植后第42天全部处死动物取脾,通过CCK-8测定T细胞、B细胞的增殖;RT-PCR测定Foxp3 mRNA的表达水平;流式细胞术测定CD4+CD25+调节性T细胞的变化,ELISA测定外周血TGF-β、IL-17和TNF-α,收集数据并做统计分析。第三部分:（1） PKH-26和Brdu标记MSCs。（2）将64只大鼠随即分成正常组和CIA组,均给予MSCs移植。（3）移植后第3、11、30、42天分别处死8只动物,取不同分组大鼠的胸腺、脾和关节组织制作病理切片,共聚焦显微镜联合免疫组化技术,观察MSCs移植后不同时点在不同脏器的迁移和分布。【结果】1.大鼠MSCs为均一的梭形的成纤维细胞样生长,贴壁及增殖能力强,生长曲线呈S型;流式细胞术鉴定为间充质干细胞。2.早晚期MSCs治疗组AI、后肢足肿胀度均较CIA对照组明显改善（P＜0.05）,早期治疗组与晚期治疗组比较,关节炎指数较低,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.早晚期CIA对照组Treg水平低于正常组和治疗组,差异有统计学意义（P＜0.05）;早期治疗组Treg比晚期治疗组有所升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。4.早晚期CIA对照组Foxp3 mRNA的表达水平比正常组和治疗组低,差异有统计学意义（P＜0.05）;早期治疗组与晚期治疗组比较差异无统计学意义（P＞0.05）,Foxp3 mRNA的表达水平与正常组接近。5.早晚期CIA对照组T、Bcell增殖水平明显高于正常组和治疗组,差异有统计学意义（P＜0.05）;早期MSCs治疗组Tcell水平低于晚期治疗组（P＜0.05）,早晚期治疗组Bcell水平接近（P＞0.05）。7.早晚期CIA对照组TGF-β1水平较正常组和治疗组低（P＜0.05）,早期治疗组TGF-β1水平高于晚期治疗组,差异有统计学意义（P＜0.05）。早晚期CIA对照组血清IL-17和TNF-α水平较正常组和治疗组升高（P＜0.05）,其中早期治疗组MSCs对IL-17的抑制优于晚期治疗组,差异有统计学意义（P＜0.05）;早晚期MSCs治疗组TNF-α被抑制的程度接近,差异无统计学意义（P＞0.05）。8.异基因骨髓MSCs移植在CIA大鼠的脾脏、胸腺、关节炎症部位可较长期（42天）的存在,归巢的MSCs细胞数量明显高于正常组。【结论】1.体外分离、培养大鼠骨髓MSCs呈现均一的成纤维细胞样生长,贴壁及增殖能力强。2.异基因MSCs移植对（早期、晚期）CIA大鼠的关节炎症状、滑膜病理都有所改善,并通过上调CIA大鼠体内Treg水平,促进Foxp3 mRNA的表达及TGF-β的分泌,抑制T、B淋巴细胞的增殖,减少血清中TNF-α、IL-17的含量,而发挥其在体内的免疫调节作用;早期治疗组的疗效优于晚期治疗组。3.异基因骨髓MSCs移植在CIA大鼠的脾脏、胸腺、关节炎症部位可较长期（42天）的存在;移植的MSCs优先定位于受损伤的组织和器官而发挥其治疗作用。
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