鲎素及儿茶素对胶质瘤U251的作用机理研究

论文摘要

本文用从动植物中提取的活性成分鲎素（tachyplesinl）和儿茶素对人脑神经胶质瘤U251的作用机理进行研究。鲎素（tachyplesinl）是一族分子量约2.3kDa的小分子多肽,相关研究证实了海洋低等动物鲎的血液中存在具有干预肿瘤细胞基因表达、调控细胞增殖分化功能的低分子肿瘤抑制物,但对中国鲎鲎素的抗肿瘤机理尚缺乏较为深入的研究。儿茶素是茶叶中提取的多酚类物质,对肿瘤有抑制作用,对抑制脑胶质瘤后研究未见报道。神经胶质瘤是一种恶性中枢神经系统肿瘤,发病率高,国内报告总的发病率约占颅内肿瘤的35.26%-60.96%,平均发病率为44.69%。目前恶性肿瘤的治疗方法仍然是以手术、化疗、放疗为主的综合治疗,神经胶质瘤是一种“韭菜”型的肿瘤,手术后生长更快,死亡率高。临床常用的化疗药物主要是通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞,但大多数化疗药物毒性大,患者不堪忍受。另一方面,某些肿瘤细胞因对化疗药物或放射线不敏感而导致治疗效果不理想。因此,临床急需开发毒性小、治疗效果好的新型抗肿瘤药物,以降低肿瘤患者死亡率。卡莫司汀（BCNU）作为胶质瘤化疗的首选药物,脂溶性高,易于通过血脑屏障,抑制DNA复制和表达,对增殖细胞各期均有作用。本文以卡莫司汀（BCNU）作对照,对鲎素抑瘤效果及作用机制作进行探讨,主要研究结果如下。本文研究了儿茶素对脑胶质瘤细胞U251增殖的抑制作用及机制,采用MTT比色法、台盼蓝细胞拒染法、Hoechst33342荧光染色、细胞周期检测等方法证实了儿茶素能抑制脑胶质瘤细胞U251的生长,从而为进一步探讨儿茶素抗癌机制提供了实验依据。儿茶素浓度为62.5μg/mL,作用12h后的抑制率达49.27%,作用24h后的抑制率达52.93%,实验组与对照组相比,随儿茶素剂量的增大,S期细胞比率逐渐增加,由26.3%上升到43.2%,细胞在S期发生了阻滞。应用鲎素处理人脑胶质瘤细胞,同时设置药物对照-化疗药卡氮芥及细胞对照-人胶质正常细胞,结合细胞生物化学、细胞分子学等手段处理细胞,研究鲎素对胶质瘤细胞U251的生物学效应,并进一步研究鲎素体外对胶质瘤细胞的作用机理。建立了胶U251、HEB细胞株体外培养体系,CCK-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐）法及台盼蓝细胞拒染法检测鲎素对人神经胶质瘤细胞U251的增殖抑制作用,透射电镜观察细胞形态,Hoechst33342/PI荧光检测鲎素对U251细胞的影响,DNA琼脂糖凝胶电泳检测凋亡的发生,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡。鲎素、BCNU质量浓度为35.33μg/mL时,U251细胞的Go/G1期DNA含量增加（P<0.01）,有极显著意义,在Go/G1期产生阻滞；鲎素、BCNU质量浓度为35.33μg/mL时,HEB细胞的S期DNA含量增加（P<0.01）,有极显著意义,在S期产生阻滞。35.33μg/mL的BCNU作用U251,凋亡率达32.9%,35.33μg/mL的鲎素作用U251,凋亡率达25.8%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 鲎素、儿茶素及BCNU概论
• 1.1.1 鲎素
• 1.1.2 儿茶素
• 1.1.3 BCNU
• 1.2 神经胶质瘤诊断和治疗原则
• 1.3 神经脑胶质瘤治疗进展
• 1.4 肿瘤细胞耐药性研究
• 1.5 鲎素在逆转肿瘤方面的研究
• 1.6 肿瘤干细胞学说
• 1.6.1 脑肿瘤干细胞的发现过程
• 1.6.2 脑肿瘤干细胞分子水平的研究
• 1.6.3 脑肿瘤干细胞的细胞信号传导通路研究
• 1.7 论文课题的来源、研究背景、意义及内容
• 1.7.1 课题来源
• 1.7.2 研究背景和意义
• 1.7.3 主要研究内容
• 第二章 儿茶素对脑胶质瘤细胞U251增殖的抑制作用及机制研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与设备
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 细胞形态学观察
• 2.1.2.2 儿茶素对U251细胞的增殖抑制作用
• 2.1.2.3 台盼蓝拒染法活观察儿茶素对U251细胞的作用
• 2.1.2.4 Hoechst33342染色检测U251细胞凋亡
• 2.1.2.5 儿茶素对细胞周期的阻滞作用
• 2.1.2.6 统计学处理
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 细胞形态变化
• 2.2.2 儿茶素对U251细胞的增殖影响
• 2.2.3 台盼蓝拒染法观察儿茶素对U251细胞的作用
• 2.2.4 儿茶素对U251细胞引起凋亡的荧光观察
• 2.2.5 儿茶素对U251细胞周期分布的影响
• 2.3 讨论
• 小结
• 第三章 鲎素和BCNU对脑胶质瘤及正常神经细胞影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与设备
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 细胞生长曲线的测定
• 3.1.2.2 细胞分裂指数侧定
• 3.1.2.3 细胞形态学观察
• 3.1.2.4 CCK-8法检测鲎素及BCNU对细胞U251、HEB的增殖作用
• 3.1.2.5 台盼蓝细胞拒染法检测鲎素及BCNU对细胞U251、HEB杀伤细胞成活率
• 3.1.2.6 Hoechst33342/PI荧光检测鲎素对脑胶质细胞增殖影响
• 3.1.2.7 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 3.1.2.8 鲎素、BCNU对U251、HEB细胞周期的影响
• 3.1.2.9 鲎素、BCNU对U251、HEB细胞凋亡的影响
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 细胞的生长曲线
• 3.2.2 细胞分裂指数测定
• 3.2.2.1 鲎素对人脑胶质瘤U251、人胶质正常细胞HEB细胞分裂的影响
• 3.2.2.2 BCNU对人脑胶质瘤U251、人胶质正常细胞HEB细胞分裂的影响
• 3.2.3 鲎素、BCNU作用细胞的形态变化
• 3.2.3.1 倒置显微镜下观察
• 3.2.3.2 透射电镜下细胞形态变化
• 3.2.4 CCK-8法检测鲎素及BCNU对细胞U251、HEB的增殖影响
• 3.2.5 台盼蓝细胞拒染法观察鲎素、BCNU对细胞的作用
• 3.2.6 Hoechst33342/PI荧光检测鲎素对脑胶质细胞U251增殖影响
• 3.2.7 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.8 鲎素、BCNU对U251、HEB细胞周期的影响
• 3.2.8.1 鲎素对U251细胞周期的影响
• 3.2.8.2 BCNU对U251细胞周期的影响
• 3.2.8.3 鲎素对HEB细胞周期的影响
• 3.2.8.4 BCNU对HEB细胞周期的影响
• 3.2.9 AnnexinV FITC染色检测细胞凋亡
• 3.3 讨论
• 小结
• 第四章 鲎素和BCNU对脑胶质瘤干细胞作用研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与设备
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 脑胶质瘤干细胞分离
• 4.1.2.2 U251干细胞培养及药物处理
• 4.2 实验结果
• 4.3 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 在学期间发表与学位论文内容相关的学术论文
• 致谢