论文摘要
目的:体外诱导分化内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,然后应用自噬激活剂雷帕霉素干预,探讨干预后的EPCs生物学特性的变化,为下肢深静脉血栓等疾病的治疗提供一种新的思路和实验依据。方法:1.密度梯度离心法获取Wistar大鼠的骨髓单个核细胞（bone marrow-derived mononuclear cells,BMMNCs）,内皮祖细胞培养基（EGM-2MV）体外诱导分化为EPCs,然后将贴壁细胞随机分成5组,一组为对照组（正常培养组） ,其余4组分别加入含雷帕霉素0.01、0.1、1、10μg/ L的EGM-2MV培养基中,各组分别培养24、48h。。2.MTT比色法观察其增殖能力。3.单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色法检测自噬囊泡.4.透射电镜观察雷帕霉素对EPCs细胞超微结构的影响5.Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白表达的变化6.流式细胞仪检测细胞凋亡情况和周期进程。采用SPSS17.0软件进行分析。结果:1、EGM-2MV培养基培养经Ficoll法分离的骨髓单个核细胞可以诱导生成EPCs;2.经雷帕霉素作用后测定的OD值呈明显降低的趋势,对照组明显高于干预组（P<0.05）。3.MDC成功对自噬囊泡染色,可以比较直观的观察到自噬囊泡的存在与荧光强度随着随着时间的延长和浓度的增加而增强。4.透射电镜下见线粒体肿胀、自噬小体的双层膜结构、染色质边集等细胞超微结构的变化。5.雷帕霉素作用细胞后LC3-Ⅱ蛋白的表达明显升高的趋势,干预组明显高于对照组（P<0.05）6.观察到了细胞凋亡呈现随着时间和浓度的增加而增加的趋势;药物使得细胞的增殖被阻滞在了G1/G0期和S期,因此进入到G2/M期的进行有丝分裂的细胞明显呈现下降的趋势。结论:雷帕霉素可以明显影响细胞周期进程,抑制细胞的增殖,促进细胞的凋亡和自噬的发生。
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