新疆番茄病毒病及植原体病害的研究

论文摘要

本文对危害新疆番茄的病毒病及植原体病害进行了研究：通过田间调查，明确新疆加工番茄病毒病的危害症状可分为花叶、蕨叶和坏死条斑三种类型，其中坏死条斑病毒病发病晚，但危害最严重。针对该病害，2007-2009年对石河子地区不同播期的加工番茄（里格87-5）进行发病率和病情指数调查，结果显示：晚播（5月20日）的发病率（67.94%）和病情指数（43.47），明显高于早播（4月5日）和适播（4月25日），三个播期间病情指数差异显著；对15个加工番茄品种（系）发病情况调查分析显示，15个品种（系）对病毒病均无显著抗性，其中‘里格87-5’、‘石番15’、‘屯河34’、‘石番18’4个品种（系）田间发病较重（病情指数为64.03～65.77）；‘新番9’、‘新番4’、‘Q027’、‘石番3’4个品种（系）田间发病相对较轻（病情指数为44.02～45.47）。建立烟草花叶病毒（TMV）、番茄花叶病毒（ToMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）及蚕豆萎蔫病毒（BBWV）五种病毒的有效检测体系。对15个加工番茄品种（系）的种子进行检测结果显示：11个品种（系）可检测到ToMV，说明种子带毒是ToMV田间发病的初侵染来源之一；2009-2012对400份田间病样进行5种病毒的分子检测，显示ToMV的侵染率（88.75%）远高于TMV的侵染率（2.50%）；田间发病主要以ToMV与另2种病毒（CMV+PVY、CMV+BBWV、PVY+BBWV）的复合侵染为主，侵染率分别为28.25%、20.75%和15.25%。对表现坏死条斑的病株通过生物学分离得到ToMV分离物XJT-1、BBWV分离物XJ14-3和CMV分离物SFQT1-2，并对其进行了全长克隆和基因组序列分析。结果显示：XJT-1基因组全长6383个核苷酸（FN985165），与Genebank中已登录的ToMV序列相似性高达98.7%～99.3%。XJ14-3基因组RNA1全长5955个核苷酸（FN985164），编码一个1870个氨基酸的多聚蛋白，与Genebank中已登录的BBWV2基因组RNA1序列相似性高达78.6%～92.4%；RNA2全长3635个核苷酸（HQ283389），编码一个1064个氨基酸的多聚蛋白，与Genebank中已登录的BBWV2基因组RNA2序列相似性高达79.9%～97.4%。CMV分离物SFQT1-2基因组包括三条正单链RNA，基因组RNA1全长为3356个核苷酸（HQ283392），编码1a蛋白，与Genebank中已登录的CMV ⅠA亚组代表株系基因组RNA1序列相似性最高；基因组RNA2全长3042个核苷酸（HQ283391），编码2a和2b蛋白；基因组RNA3全长2219个核苷酸（HQ283393），编码移动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP），SFQT1-2基因组RNA2和RNA3与CMV亚组ⅠB代表株系的序列相似性高。CP基因核酸序列系统发生树分析表明，SFQT1-2属于CMV亚组ⅠB。为明确危害新疆喀什温室番茄的病毒种类，利用双生病毒兼并引物对表现黄化曲叶症状的番茄植株进行PCR检测，8株番茄样品均扩增到约500bp的特异片段，从中选取分离物KS2-5克隆测序。结果显示该片段由543个核苷酸组成，与番茄黄化曲叶病毒（TYLCV） DNA-A相似性达99.5%。对KS2-5进行全基因组DNA-A的克隆和测序，KS2-5DNA-A全长为2781个核苷酸（JQ807735），具有典型的双生病毒基因组特征，与TYLCV各分离物同源性达98.6%～99.5%，而与其他双生病毒的序列相似性却低于75.4%。由此表明，新疆喀什温室番茄黄化曲叶病由TYLCV引起。为明确表现丛枝、小叶、花器变形的加工番茄病原种类，利用植原体通用引物R16mF2/R16mR1对2株显症番茄植株（SYC-1，ZYT-3）的16S rRNA基因进行PCR扩增，均扩增出约1400bp的目标条带，测序结果表明，二者序列相似性达99.8%，均与三叶草丛簇组（16SrⅥ）成员相似性最高（高于98.4%）；利用iPhyClassifier在线分析表明，番茄植原体16S rRNA基因的RFLP图谱与16SrⅥ-A亚组代表株AY39021完全相同。基于16S rRNA基因的核酸序列系统发生树分析表明，二者均与16SrⅥ-A亚组分离物位于同一亚分枝上。这说明侵染加工番茄的植原体属于三叶草丛簇组（16SrⅥ）A亚组。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• Ⅰ 番茄病毒病研究进展
• 1.1 番茄主要病毒病发生概况
• 1.1.1 番茄病毒病田间主要症状和危害
• 1.1.2 番茄病毒病的主要分布及种类
• 1.1.3 新疆番茄病毒病的研究现状
• 1.2 番茄主要病毒研究进展
• 1.2.1 烟草花叶病毒属 （Tobamovirus）及烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的研究
• 1.2.2 番茄花叶病毒（Tomato Mosaic Virus，ToMV）的研究进展
• 1.2.3 蚕豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus，BBWV）的研究进展
• 1.2.4 黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）的研究进展
• 1.2.5 双生病毒（Geminiviruses）的研究进展
• 1.3 番茄病毒检测方法研究
• 1.3.1 生物学方法
• 1.3.2 电镜技术
• 1.3.3 血清学技术
• 1.3.4 分子生物学技术
• Ⅱ 番茄植原体病害研究进展
• 1.4 植原体（Phytoplasma）概述及其系统分类
• 1.4.1 植原体概述
• 1.4.2 植原体的系统分类
• 1.5 植原体病害症状特点、传播及危害
• 1.6 植原体的地理分布
• 1.7 番茄巨芽病研究进展
• 1.8 植原体检测技术
• 1.8.1 组织化学法检测
• 1.8.2 电子显微镜检测
• 1.8.3 血清学检测
• 1.8.4 PCR 检测
• 1.9 本研究的目的与意义
• 第二章 加工番茄病毒病田间发生情况研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试加工番茄品种（系）
• 2.1.2 加工番茄田间种植方法
• 2.1.3 田间病害调查方法
• 2.1.4 发病率与病情指数计算方法
• 2.1.5 显著性分析方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 加工番茄病毒病症状调查
• 2.2.2 不同播期的加工番茄坏死条斑病发病情况
• 2.2.3 不同品种（系）的加工番茄坏死条斑病发病情况
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 加工番茄种子及田间病株主要病毒的分子检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 种子检测供试材料
• 3.1.2 田间病株
• 3.1.3 常用试剂和溶液的配制
• 3.1.4 仪器
• 3.1.5 用于 PCR 扩增的引物、质粒及酶
• 3.1.6 植物总 RNA 的提取
• 3.1.7 病毒 cDNA 合成及 PCR 反应体系与条件
• 3.1.8 PCR 产物电泳检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 五种病毒有效检测体系的建立
• 3.2.2 15 个品种（系）加工番茄种子带毒情况的 RT-PCR 检测
• 3.2.3 加工番茄病毒病田间病原的分子检测
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 加工番茄坏死条斑病主要毒原的分子鉴定
• 4.1 材料方法
• 4.1.1 植物材料及病原分离
• 4.1.2 菌种和载体
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 用于 PCR 扩增的引物
• 4.1.5 用于比对分析的序列
• 4.1.6 植物总 RNA 的提取
• 4.1.7 植物病毒双链 RNA（dsRNA）的提取
• 4.1.8 cDNA 第一链的合成
• 4.1.9 PCR 扩增
• 4.1.10 PCR 产物加 A
• 4.1.11 PCR 产物电泳检测
• 4.1.12 PCR 产物的纯化
• 4.1.13 PCR 产物的连接、转化
• 4.1.14 重组质粒的提取和鉴定
• 4.1.15 序列分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 dsRNA 方法检测加工番茄条斑型病毒病毒原复合情况
• 4.2.2 加工番茄坏死条斑病毒病毒源分离
• 4.2.3 XJT-1、SFQT1-2 和 XJ14-3 三个分离物的分子检测
• 4.2.4 ToMV 基因组全序列的克隆及序列分析
• 4.2.5 BBWV2 基因组全序列的克隆与序列分析
• 4.2.6 CMV 基因组全序列的克隆与序列分析
• 4.3 结论与讨论
• 第五章 温室番茄双生病毒的分子鉴定
• 5.1 材料方法
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 菌种和载体
• 5.1.3 试剂
• 5.1.4 引物
• 5.1.5 用于序列比对和构建进化树的病毒
• 5.1.6 植物总 DNA 的提取
• 5.1.7 PCR 扩增
• 5.1.8 PCR 产物的连接转化及阳性克隆的鉴定
• 5.1.9 序列分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 新疆鲜食番茄双生病毒危害症状
• 5.2.2 双生病毒田间样品的分子检测：
• 5.2.3 病毒分离物 KS2-5 的基因组 DNA-A 的克隆和测序
• 5.2.4 KS2-5 病毒基因组 DNA-A 结构分析
• 5.2.5 KS2-5 病毒基因组 DNA-A 与其它双生病毒的比较
• 5.2.6 KS2-5 与其它双生病毒的分子进化分析
• 5.3 结论与讨论
• 第六章 加工番茄植原体病害相关病原的分子鉴定
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 植物材料
• 6.1.2 菌种和载体
• 6.1.3 试剂
• 6.1.4 引物
• 6.1.5 用于植原体 16S rRNA 基因比对的序列
• 6.1.6 植物总 DNA 的提取
• 6.1.7 PCR 扩增
• 6.1.8 PCR 产物的连接转化及阳性克隆的鉴定
• 6.1.9 序列分析
• 6.1.10 iPhyClassifier 在线分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 加工番茄植原体病害的田间症状
• 6.2.2 加工番茄植原体 16Sr RNA 基因的 PCR 检测
• 6.2.3 16Sr RNA 基因的序列分析
• 6.2.4 iPhyClassifier 在线分析
• 6.2.5 SYC-1、ZYT-3 与其它植原体 16Sr RNA 基因进化关系
• 6.3 结论与讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文清单及获奖
• 导师评阅表