油茶优良种质资源的收集保存与遗传关系的分子鉴别

论文摘要

油茶种质资源大多具有一定的经济性状和相应的生物学和生态学特性,油茶是异花授粉植物,通过自然杂交产生的丰富的变异群体,这是产生优良种质资源的基础。由于油茶种质资源大多分散在不同的地区,所表现出的优良性状,通过长期和大量的调查观测才能发现。为了更好地比较其主要特点和经济性状,深入研究其特性和进行应用价值综合评价,需要对优良油茶种质资源进行搜集保存和评价。本研究以全国油茶主产省份的75份优良种质资源材料为研究材料,利用形态学分类结合ISSR和SRAP分子标记技术鉴别出不同油茶品种（系）的遗传差异和亲缘关系,初步构建起全国优良油茶种质资源的分子鉴定识别体系。主要研究结果和结论如下:（1）收集并保存了福建省福州市闽侯县、龙岩市连城县和上杭县、三明市清流县和大田县、尤溪县、南平市浦城县、宁德市霞浦县等种源地有代表性的35份优良油茶农家品种,福建省闽侯桐口国有林场闽优系列亲本林和杂交F1代油茶枝条和果实以及攸县油茶、岑溪软枝油茶等林场引种品种22份,以及全国油茶主产省份油茶优良无性系种质资源,包括江西长林系列长林166#等15个优良无性系,湖南湘林系列湘林47等6个优良无性系,浙53号等40份油茶优良无性系品种。对其中的75份材料油茶果实性状指标数据进行方差分析、相关性分析、主成分分析、聚类分析,得到油茶种质资源的果实性状上存在丰富的多样性。（2）探索出一套在传统CTAB法上进行改良的油茶基因组DNA提取方法,该方法也适用于油茶老叶的提取。通过使用纯化试剂盒对油茶样品进行纯化,使纯化后油茶基因组DNA样品的OD260/OD280比值在1.70-1.90之间,完全符合ISSR-PCR和SRAP-PCR扩增的模板条件。（3）通过单因素和正交分析法对ISSR和SRAP反应体系进行优化:ISSR-PCR体系优化结果是Mg2+浓度2.00 mmol/L、dNTP浓度0.2mmol/L、Taq酶浓度1U、Primer浓度0.2 mmol/L、DNA模板的量30ng;SRAP-PCR体系优化结果是Mg2+浓度2.25mmol/L、dNTP浓度0.20mmol/L、Primer浓度各1.0umol/L、Taq酶浓度1.25U、DNA模板的量30ng。（4）ISSR标记和SRAP标记各筛选出20条引物（组合）对75个油茶参试样品进行扩增,得到ISSR标记和SRAP标记的总位点数、多态位点数、公共位点数、平均多态位点比例（PPB）和多态性谱带的范围。计算得到遗传多样性参数中ISSR标记和SRAP标记的观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）个数、群体的Shannon多样性指数（I）、Nei’s基因多样性（H）、群体总基因多样性（Ht）、群体内基因多样性（Hs）、基因分化系数（Gst）、基因流（Nm）的值和总群体基因流（Nm）的值均说明无论是75个油茶参试样品总群体还是6个分类群都存在着油茶种质资源丰富的遗传多样性。（5）基于ISSR-PCR和SRAP-PCR的扩增结果,根据Nei & Li （Czekanowski 1913）相似性系数应用UPGMA法对75个油茶参试样品进行聚类分析。ISSR-PCR聚类结果显示当平均遗传距离GD取值约为0.40时,75个供试样品按照品种划分为四个大类,基本分别为普通油茶、小果油茶、软枝油茶和红花油茶;SRAP-PCR聚类结果显示当平均遗传距离GD取值约为0.34时,75个供试样品按照品种划分为五个大类,分别为普通油茶、小果油茶、攸县油茶+连城油茶、软枝油茶和红花油茶,基本能鉴别出不同油茶品种（系）的遗传差异及其亲缘关系。（6）通过的1/0矩阵数据分析和DNA指纹图谱的比对, 9条ISSR引物扩增出11个特异性位点标记可一次鉴别11个样品,10对SRAP引物组合扩增出18个特异性位点标记可一次鉴别14个样品,SRAP标记一个样品可用2-3个SRAP引物组合鉴定。其中样品闽优48、福林1号可同时用两种标记鉴别,可进一步提高样品分子鉴别的正确率。两种标记可一次鉴定的样品达23种,并分别列出了不同油茶品种（系）的识别卡。以上研究从果实性状、分子水平上揭示了油茶优良种质资源的遗传多样性,构建的ISSR标记和SRAP标记的指纹图谱对油茶优良品种的鉴定极有价值,为建立和完善油茶种质资源基因库奠定基础,为进一步杂交选育和遗传改良提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 油茶种质资源的概况
• 1.1.1 油茶的分布和分类
• 1.1.2 油茶形态学特性
• 1.1.3 油茶生物学特性
• 1.1.3.1 根系生长特性
• 1.1.3.2 新梢生长
• 1.1.3.3 开花结果习性
• 1.2 油茶种质资源的收集与保存
• 1.2.1 油茶种质资源的收集与保存的意义
• 1.2.2 油茶种质资源的收集与保存的现状
• 1.2.3 油茶种质资源的收集与保存的方法
• 1.2.3.1 摸清当地主栽品种类型
• 1.2.3.2 发掘地方品种
• 1.2.3.3 种质资源的调查搜集的方法
• 1.2.3.4 种质资源的保存的方法
• 1.2.4 油茶种质资源的形态学鉴定
• 1.3 植物遗传关系研究中的分子标记技术
• 1.3.1 分子标记技术的种类
• 1.3.1.1 RFLP（Restriction Fragment Length Polymerphism）限制性多态长度多态性
• 1.3.1.2 RAPD（RandomAmplified Polymorphism DNA）随机扩增多态性DNA
• 1.3.1.3 ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats）简单序列重复区间
• 1.3.1.4 AFLP（Amplified Fragment Length Polymerphism）扩增片断长度多态性
• 1.3.1.5 SRAP（Sequence–Related Amplified Polymorphism）相关序列扩增多态性
• 1.3.2 分子标记在油茶遗传关系分析上的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 材料的来源
• 2.1.1.1 福建省油茶主产区农家品种
• 2.1.1.2 全国油茶主产省份油茶优良无性系种质资源
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 油茶种质资源的调查
• 2.2.2 油茶种质资源的收集
• 2.2.3 油茶种质资源的保存
• 2.2.4 果实特征测量指标和方法
• 2.2.5 基因组DNA 的提取和纯化
• 2.2.5.1 油茶基因组DNA 提取方法
• 2.2.5.2 油茶DNA 纯化方法
• 2.2.5.3 基因组DNA 的测定
• 2.2.6 PCR 反应体系和程序
• 2.2.6.1 ISSR－PCR 分析
• 2.2.6.2 SRAP－PCR 分析
• 2.2.7 引物的筛选
• 2.2.7.1 ISSR 引物的筛选
• 2.2.7.2 SRAP 引物的筛选
• 2.3 数据处理和指标计算
• 3 结果与分析
• 3.1 油茶果实特征的多样性分析
• 3.1.1 油茶果实特征的方差分析
• 3.1.2 油茶果实特征指标间的相关性和主成份分析
• 3.1.3 油茶果实特征的聚类分析
• 3.2 ISSR 反应体系的优化
• 3.2.1 单因素分析法优化ISSR 体系
• 2+离子浓度'>3.2.1.1 Mg²⁺离子浓度
• 3.2.1.2 三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）浓度
• 3.2.1.3 引物（Primer）浓度
• 3.2.1.4 r-Taq 酶浓度
• 3.2.1.5 DNA 模版含量
• 3.2.1.6 退火温度
• 3.2.2 利用正交设计优化ISSR 反应体系
• 3.2.3 油茶样品的ISSR 扩增结果
• 3.2.4 油茶样品ISSR 遗传多样性分析
• 3.2.5 油茶样品ISSR 遗传关系的聚类分析
• 3.2.6 油茶样品的ISSR 分子鉴别
• 3.3 SRAP 反应体系的建立和优化
• 3.3.1 单因素分析法优化SRAP 体系
• 2+离子浓度'>3.3.1.1 Mg²⁺离子浓度
• 3.3.1.2 三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）浓度
• 3.3.1.3 引物（Primer）浓度
• 3.3.1.4 r-Taq 酶含量
• 3.3.1.5 DNA 模版含量
• 3.3.1.6 退火温度
• 3.3.2 利用正交设计优化SRAP 反应体系
• 3.3.3 油茶样品的SRAP 扩增结果
• 3.3.4 油茶样品SRAP 遗传多样性分析
• 3.3.5 油茶样品SRAP 遗传聚类分析
• 3.3.6 油茶样品的SRAP 分子鉴别
• 3.4 果实性状标记与ISSR、SRAP 标记聚类结果相关性分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 油茶基因组DNA 的提取和纯化
• 4.2 油茶样品ISSR-PCR 和SRAP-PCR 体系建立
• 4.3 油茶样品ISSR 标记和SRAP 标记的结果比较
• 4.3.1 遗传多样性结果
• 4.3.2 聚类分析结果
• 4.3.3 分子鉴别结果
• 4.4 油茶种质资源收集与保存问题
• 4.5 油茶果实特征的多样性分析
• 参考文献
• 致谢