论文摘要
实验背景及目的Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal,ICC）广泛分布于消化道,是胃肠慢波活动的起搏细胞及其基本电节律的主要传播细胞[1],并参与胃肠道神经信息的传递[2]。近年研究表明,ICC与众多胃肠道疾病关系密切,其分布异常、数目减少及超微结构改变可能是这些疾病发病的重要病理生理机制之一。溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种非特异性结肠、直肠炎性疾病,病变主要局限于粘膜与粘膜下层。迄今为止,UC病因和发病机制尚未完全阐明,一般认为与免疫、过敏、遗传及非特异性感染等因素有关。近年研究显示,UC患者肠壁ICC可发生不同程度缺失、减少及发生超微结构改变[3],可能影响神经信号传递及平滑肌细胞（smooth mucle cell,SMC）功能,从而引起疾病伴发的肠运动功能障碍。近年,UC在我国发病率呈升高趋势,因此建立合适的动物模型,进一步深入认识UC发病机制和开发治疗药物有重要意义。多项研究表明,葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）诱导的BALB/c小鼠UC模型具有简单易行,成功率高,重复性好,适用范围广,与人类UC病变类似等优点[4,5]。但迄今为止,国内外文献未见有关UCBALB/c小鼠结肠或直肠ICC分布及超微结构变化的研究。本实验通过DSS法建立BALB/c小鼠急、慢性UC动物模型,观察UC小鼠远段结肠组织中ICC分布和超微结构变化,并与人类UC结肠ICC分布和超微结构变化相比较,进一步探讨UC发病与ICC分布和超微结构变化的关系,同时深入比较BALB/c小鼠UC动物模型结肠病理改变与人类UC病理改变情况的相似性,为BALB/c小鼠UC动物模型是否可以有效用于研究UC发病机制和药物治疗提供必要的实验依据。实验方法第一部分:BALB/c小鼠急、慢性UC动物模型的制备和鉴定。根据Cooper等[4,5]的方法建立急、慢性DSS小鼠UC模型:①将DSS溶于蒸馏水,配制成5%DSS溶液,让BALB/c小鼠自由饮用7d,建立小鼠急性UC模型;②BALB/c小鼠自由饮用5%DSS溶液7d,然后饮用不含DSS的蒸馏水14d,建立小鼠慢性UC模型;③将仅饮用蒸馏水的BALB/c小鼠作为对照组。实验过程中观察小鼠每日体重、大便性状和隐血情况,以及结肠大体形态和病理改变。分别取三组小鼠远段结肠组织标本,常规石蜡包埋、切片、HE染色,行组织病理学鉴定。第二部分:BALB/c小鼠UC远段结肠Cajal间质细胞分布的观察。分别取三组小鼠远段结肠组织标本,制备冰冻切片,采用酪氨酸激酶受体（c-kit）抗体免疫荧光组织化学法观察ICC分布,应用OLYMPUS FV1000激光共聚焦显微镜进行c-kit荧光定量表达检测。第三部分:BALB/c小鼠UC远段结肠Cajal间质细胞超微结构的观察。分别取三组小鼠远段结肠组织标本,固定、脱水、包埋,常规超薄切片,采用硝酸铅、醋酸铀染色,JEM-2000EX透射电子显微镜观察。实验结果1、成功制备BALB/c小鼠急、慢性UC动物模型,并经组织病理学证实。2、免疫荧光和激光共聚焦荧光定量结果:⑴正常对照组BALB/c小鼠远段结肠组织中ICC主要分布于粘膜下丛（IC-SM）和肌间丛（IC-MY）,IC-MY在切面上几乎呈现连续性分布,相互连接形成网络状结构。⑵急性UC组小鼠远段结肠组织内ICC的分布较正常对照组和慢性UC组小鼠显著减少（P<0.001）,IC-MY的网络状结构完全破坏,残存ICC形态也出现异常。⑶慢性UC组小鼠远段结肠组织内ICC的分布较正常对照组减少（P<0.05）,但较急性UC组显著增加（P<0.001）,其形态接近正常,但IC-MY的连续性分布不明显,未能形成正常的网络状结构。3、透射电子显微镜观察结果:⑴正常对照组BALB/c小鼠远段结肠ICC超微结构主要特点:细胞呈纺锤形,有巨大的卵圆形核及向外伸展的长突起,胞质内有丰富的线粒体、大量光面内质网和粗面内质网;环肌层和纵肌层ICC与肠神经元之间形成突触样连接。⑵急性UC组小鼠远段结肠ICC超微结构改变:细胞体积增大,线粒体肿胀、电子密度降低,溶酶体数目增多,出现次级溶酶体;部分ICC胞浆内可见大量脂滴;IC-SM周围出现大量巨噬细胞。⑶慢性UC组小鼠远段结肠ICC超微结构改变:细胞形态基本正常,线粒体形态基本正常或轻度肿胀,溶酶体数目增多,以初级溶酶体为主;IC-SM周围巨噬细胞数目较少,可见较多透明小泡。结论1、BALB/c小鼠UC远段结肠组织内ICC分布减少,形态异常,超微结构发生改变,推测与UC小鼠肠功能紊乱有一定相关性。2、BALB/c小鼠UC动物模型结肠病理改变与人类UC病理改变情况相似, ICC分布变化及超微结构改变亦与人类UC改变情况相似,该模型可作为研究UC发病机制和药物治疗的理想工具。