新型生物农药米多霉素类化合物的生物合成和活性评价

新型生物农药米多霉素类化合物的生物合成和活性评价

论文摘要

米多霉素(mildiomycin, MIL)是从放线菌Streptoverticillium rimofaciens的培养液中分离到的一种核苷类次级代谢产物,对多种植物的白粉病具有显著防治作用。本文研究目的在于通过在培养过程中添加米多霉素的理论前体:羟甲基胞嘧啶的结构类似物,利用微生物自身的合成代谢体系合成多种米多霉素的结构类似物,以获得活性更高的生物农药。对其中两种衍生物:米多霉素胞嘧啶衍生物(MIL-C)和米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物(MIL-F),开展了发酵条件和分离工艺优化,并进行了分子结构鉴定、生物活性和毒性评价。1.在Streptoverticillium rimofaciens的培养过程中添加5-氟胞嘧啶后,获得了米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物(MIL-F)。通过对发酵条件优化,使MIL-F产量提高到了0.6g/l。对从发酵液分离提取MIL-F工艺进行了研究,获得了纯度超过95%的MIL-F产品。采用红外光谱、核磁共振及质谱分析等方法证明了所获得的MIL-F产物的分子结构确实是氟原子取代了MIL中胞嘧啶环上的羟甲基。考察了MIL-F的生物活性及毒理学性质,确定了MIL-F是一种高效、低毒、无刺激的生物农药。2.在Streptoverticillium rimofaciens的培养基中添加胞嘧啶后,获得了米多霉素胞嘧啶衍生物(MIL-C)。考察了MIL-C发酵条件,发现适当控制胞嘧啶加入量可以抑制米多霉素合成,使MIL-C成为唯一产物;通过单因素实验、Plackett-Burman实验和响应面中心组合实验使MIL-C的产量达到1336.5 mg/l,比优化前产量提高了3.6倍。在详细研究了MIL-C在DK110弱酸性阳离子交换树脂上的离子交换特性的基础上,通过优化离子交换条件分离得到了纯度约70%的MIL-C粗产品。经树脂吸附脱色和CM650离子交换凝胶柱精制,使MIL-C纯度达到了95%以上。采用全波段扫描、核磁共振及质谱分析等方法证明了所获得的MIL-F产物的分子结构确实是氢原子取代了MIL中胞嘧啶环上的羟甲基。3.考察了MIL-C的体内、体外生物活性,并开展了一年两地的田间小区实验。实验结果表明MIL-C制剂对南瓜白粉病和黄瓜白粉病都具有显著防效,药力控制良好。MIL-C对南瓜和黄瓜安全,对花和果实生长均无不利影响,对周围环境友好。对MIL-C进行安全性评价确定MIL-C是一种低毒、无刺激的农用抗生素。4.结合chemoffce组件对MIL、MIL-C和MIL-F参数进行分析比较,可以初步推断MIL的主要药效基团是可能是精氨酸上的胍基,该结构如果被破坏会导致MIL失活。通过本论文的研究,获得了两种米多霉素的结构类似物:MIL-F和MIL-C;经发酵工艺优化,大幅度提高了它们的产量;对生物活性的测试结果表明,它们对白粉病的防治效果都高于米多霉素,有可能成为高效、低毒的新型农药。对米多霉素及其类似物结构-功能关系的研究为将来发现新农药打下了良好的基础。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 白粉病和米多霉素
  • 1.1.1 国内白粉病流行现状
  • 1.1.2 国内外白粉病的防治
  • 1.2 米多霉素国内外研究进展
  • 1.2.1 米多霉素的分子结构
  • 1.2.2 米多霉素的理化性质
  • 1.2.3 米多霉素的分析方法
  • 1.2.4 米多霉素的生物活性以及安全性评价
  • 1.2.5 米多霉素产生菌的菌种选育
  • 1.2.6 米多霉素的发酵技术
  • 1.2.7 MIL在体内可能的合成机理以及对真菌的可能作用机制
  • 1.2.8 米多霉素的分离提取过程
  • 1.3 先导化合物和米多霉素类衍生物研究进展
  • 1.3.1 先导化合物的研究进展
  • 1.3.2 米多霉素类衍生物研究进展
  • 1.4 计算机辅助设计
  • 1.4.1 计算机辅助药物设计的一般方法
  • 1.4.2 计算机辅助药物设计常用计算程序和常用软件
  • 1.4.3 计算机模拟研究应用实例
  • 1.5 本论文的研究目的及主要研究内容
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 实验材料与仪器
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.2 实验设备
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 米多霉素衍生物的生物合成
  • 2.2.2 米多霉素衍生物的分析方法
  • 2.3.3 生物测定法
  • 第三章 米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物生物合成及分离纯化
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 MIL-F发酵液的预处理
  • 3.2.2 MIL-F分离提取
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 前体添加时间对MIL-F表达量的影响
  • 3.3.2 不同装液量对MIL-F生物合成的影响
  • 3.3.3 含氮化合物对MIL-F生物合成的影响
  • 3.3.4 前体添加浓度对MIL-F生物合成的影响
  • 3.3.5 培养时间对MIL-F生物合成的影响
  • 3.3.6 MIL-F分离纯化工艺
  • 3.3.6.1 MIL-F发酵液的预处理
  • 3.3.6.2 MIL-F粗产品的制备
  • 3.3.6.3 MIL衍生物的精制
  • 3.3.7 MIL-F发酵液的发酵分离耦合
  • 3.4 本章小结
  • 第四章 米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物的结构验证及活性、安全性评价
  • 4.1 引言
  • 4.2 MIL-F结构预测
  • 4.2.1 MIL-F理化性质
  • 4.2.2 米多霉素结构的仪器分析
  • 4.3 MIL-F活性测定
  • 4.3.1 MIL-F体外活性测定
  • 4.3.2 MIL-F体内活性测定
  • 4.4 MIL-F毒理学性质研究
  • 4.4.1 材料与方法
  • 4.4.2 实验结果与结论
  • 4.5 本章小结
  • 第五章 米多霉素胞嘧啶衍生物生物合成及培养条件优化
  • 5.1 引言
  • 5.2 实验方法
  • 5.2.1 米多霉素胞嘧啶衍生物的生物合成
  • 5.2.2 MIL-C培养条件优化
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 单因素优化实验
  • 5.3.2 Plackett-Burman实验
  • 5.3.3 响应面设计
  • 5.3.4 优化后培养基发酵能力的验证
  • 5.4 本章小结
  • 第六章 MIL-C分离纯化条件的优化
  • 6.1 引言
  • 6.2 发酵液的预处理
  • 6.3 MIL-C在离子交换树脂上的离子交换过程
  • 6.3.1 离子交换树脂的静态筛选
  • 6.3.2 MIL-C在离子交换树脂上的离子交换动力学
  • 6.3.3 pH值对DK110树脂吸附容量的影响
  • 6.3.4 MIL-C在离子交换树脂柱上的穿透曲线
  • 6.3.5 离子交换吸附等温线
  • 6.4 含胞嘧啶和MIL-C发酵液在DK110树脂上的固定床离子交换模型
  • 6.4.1 动力学模型理论
  • 6.4.2 模型参数的确定
  • 6.4.3 模型预测
  • 6.5 MIL-C在离子交换树脂上的洗脱过程
  • 6.5.1 MIL-C在树脂上的洗脱曲线
  • 6.5.2 洗脱剂的筛选
  • 6.5.3 洗脱流速对洗脱过程的影响
  • 6.5.4 洗脱剂浓度对洗脱过程的影响
  • 6.6 MIL-C发酵液的脱色过程
  • 6.6.1 MIL-C发酵液中色素标准曲线
  • 6.6.2 脱色树脂的筛选
  • 6.6.3 pH值对脱色效果的影响
  • 6.7 MIL-C粗产品的精制过程
  • 6.7.1 C18填料柱层析
  • 6.7.2 CM650离子交换层析
  • 6.8 本章小结
  • 第七章 MIL-C的结构验证、生物活性和毒理学评价
  • 7.1 引言
  • 7.2 MIL-C的结构验证
  • 7.2.1 MIL-C理化性质
  • 7.2.2 MIL-C的HPLC分析
  • 7.2.3 MIL-C薄层层析测定
  • 7.2.4 全波段扫描
  • 7.2.5 1H-NMR图谱
  • 7.2.6 ESI图谱
  • 7.3 MIL-C的活性分析
  • 7.3.1 MIL-C体外活性评价
  • 7.3.2 MIL-C盆栽实验
  • 7.3.3 MIL-C田间小区实验
  • 7.4 MIL-C的毒理学研究
  • 7.5 本章小结
  • 第八章 米多霉素类化合物的CADD模拟研究
  • 8.1 引言
  • 8.2 方法
  • 8.2.1 米多霉素类化合物的低能构象和能场分布
  • 8.2.2 米多霉素类化合物的结构模拟
  • 8.2.3 米多霉素类化合物的抗菌基团预测
  • 8.3 结果与讨论
  • 8.3.1 米多霉素类化合物的低能构象和相关参数分析
  • 8.3.2 米多霉素类化合物的结构模拟
  • 8.4 米多霉素类化合物抗菌活性药效团预测
  • 8.5 本章小结
  • 第九章 结论与展望
  • 9.1 实验结论
  • 9.2 展望
  • 参考文献
  • 博士期间己发表录用的文章
  • 附图一 MIL-F核磁共振氢谱
  • 附图二 MIL-F电喷雾-阳离子质谱
  • 附图三 MIL-C核磁共振氢谱
  • 附图四 MIL-C电喷雾-阳离子质谱
  • 相关论文文献

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