论文摘要
米多霉素(mildiomycin, MIL)是从放线菌Streptoverticillium rimofaciens的培养液中分离到的一种核苷类次级代谢产物,对多种植物的白粉病具有显著防治作用。本文研究目的在于通过在培养过程中添加米多霉素的理论前体:羟甲基胞嘧啶的结构类似物,利用微生物自身的合成代谢体系合成多种米多霉素的结构类似物,以获得活性更高的生物农药。对其中两种衍生物:米多霉素胞嘧啶衍生物(MIL-C)和米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物(MIL-F),开展了发酵条件和分离工艺优化,并进行了分子结构鉴定、生物活性和毒性评价。1.在Streptoverticillium rimofaciens的培养过程中添加5-氟胞嘧啶后,获得了米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物(MIL-F)。通过对发酵条件优化,使MIL-F产量提高到了0.6g/l。对从发酵液分离提取MIL-F工艺进行了研究,获得了纯度超过95%的MIL-F产品。采用红外光谱、核磁共振及质谱分析等方法证明了所获得的MIL-F产物的分子结构确实是氟原子取代了MIL中胞嘧啶环上的羟甲基。考察了MIL-F的生物活性及毒理学性质,确定了MIL-F是一种高效、低毒、无刺激的生物农药。2.在Streptoverticillium rimofaciens的培养基中添加胞嘧啶后,获得了米多霉素胞嘧啶衍生物(MIL-C)。考察了MIL-C发酵条件,发现适当控制胞嘧啶加入量可以抑制米多霉素合成,使MIL-C成为唯一产物;通过单因素实验、Plackett-Burman实验和响应面中心组合实验使MIL-C的产量达到1336.5 mg/l,比优化前产量提高了3.6倍。在详细研究了MIL-C在DK110弱酸性阳离子交换树脂上的离子交换特性的基础上,通过优化离子交换条件分离得到了纯度约70%的MIL-C粗产品。经树脂吸附脱色和CM650离子交换凝胶柱精制,使MIL-C纯度达到了95%以上。采用全波段扫描、核磁共振及质谱分析等方法证明了所获得的MIL-F产物的分子结构确实是氢原子取代了MIL中胞嘧啶环上的羟甲基。3.考察了MIL-C的体内、体外生物活性,并开展了一年两地的田间小区实验。实验结果表明MIL-C制剂对南瓜白粉病和黄瓜白粉病都具有显著防效,药力控制良好。MIL-C对南瓜和黄瓜安全,对花和果实生长均无不利影响,对周围环境友好。对MIL-C进行安全性评价确定MIL-C是一种低毒、无刺激的农用抗生素。4.结合chemoffce组件对MIL、MIL-C和MIL-F参数进行分析比较,可以初步推断MIL的主要药效基团是可能是精氨酸上的胍基,该结构如果被破坏会导致MIL失活。通过本论文的研究,获得了两种米多霉素的结构类似物:MIL-F和MIL-C;经发酵工艺优化,大幅度提高了它们的产量;对生物活性的测试结果表明,它们对白粉病的防治效果都高于米多霉素,有可能成为高效、低毒的新型农药。对米多霉素及其类似物结构-功能关系的研究为将来发现新农药打下了良好的基础。
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致谢摘要ABSTRACT第一章 文献综述1.1 白粉病和米多霉素1.1.1 国内白粉病流行现状1.1.2 国内外白粉病的防治1.2 米多霉素国内外研究进展1.2.1 米多霉素的分子结构1.2.2 米多霉素的理化性质1.2.3 米多霉素的分析方法1.2.4 米多霉素的生物活性以及安全性评价1.2.5 米多霉素产生菌的菌种选育1.2.6 米多霉素的发酵技术1.2.7 MIL在体内可能的合成机理以及对真菌的可能作用机制1.2.8 米多霉素的分离提取过程1.3 先导化合物和米多霉素类衍生物研究进展1.3.1 先导化合物的研究进展1.3.2 米多霉素类衍生物研究进展1.4 计算机辅助设计1.4.1 计算机辅助药物设计的一般方法1.4.2 计算机辅助药物设计常用计算程序和常用软件1.4.3 计算机模拟研究应用实例1.5 本论文的研究目的及主要研究内容第二章 材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 实验材料2.1.2 实验设备2.2 实验方法2.2.1 米多霉素衍生物的生物合成2.2.2 米多霉素衍生物的分析方法2.3.3 生物测定法第三章 米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物生物合成及分离纯化3.1 引言3.2 实验方法3.2.1 MIL-F发酵液的预处理3.2.2 MIL-F分离提取3.3 结果与讨论3.3.1 前体添加时间对MIL-F表达量的影响3.3.2 不同装液量对MIL-F生物合成的影响3.3.3 含氮化合物对MIL-F生物合成的影响3.3.4 前体添加浓度对MIL-F生物合成的影响3.3.5 培养时间对MIL-F生物合成的影响3.3.6 MIL-F分离纯化工艺3.3.6.1 MIL-F发酵液的预处理3.3.6.2 MIL-F粗产品的制备3.3.6.3 MIL衍生物的精制3.3.7 MIL-F发酵液的发酵分离耦合3.4 本章小结第四章 米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物的结构验证及活性、安全性评价4.1 引言4.2 MIL-F结构预测4.2.1 MIL-F理化性质4.2.2 米多霉素结构的仪器分析4.3 MIL-F活性测定4.3.1 MIL-F体外活性测定4.3.2 MIL-F体内活性测定4.4 MIL-F毒理学性质研究4.4.1 材料与方法4.4.2 实验结果与结论4.5 本章小结第五章 米多霉素胞嘧啶衍生物生物合成及培养条件优化5.1 引言5.2 实验方法5.2.1 米多霉素胞嘧啶衍生物的生物合成5.2.2 MIL-C培养条件优化5.3 结果与讨论5.3.1 单因素优化实验5.3.2 Plackett-Burman实验5.3.3 响应面设计5.3.4 优化后培养基发酵能力的验证5.4 本章小结第六章 MIL-C分离纯化条件的优化6.1 引言6.2 发酵液的预处理6.3 MIL-C在离子交换树脂上的离子交换过程6.3.1 离子交换树脂的静态筛选6.3.2 MIL-C在离子交换树脂上的离子交换动力学6.3.3 pH值对DK110树脂吸附容量的影响6.3.4 MIL-C在离子交换树脂柱上的穿透曲线6.3.5 离子交换吸附等温线6.4 含胞嘧啶和MIL-C发酵液在DK110树脂上的固定床离子交换模型6.4.1 动力学模型理论6.4.2 模型参数的确定6.4.3 模型预测6.5 MIL-C在离子交换树脂上的洗脱过程6.5.1 MIL-C在树脂上的洗脱曲线6.5.2 洗脱剂的筛选6.5.3 洗脱流速对洗脱过程的影响6.5.4 洗脱剂浓度对洗脱过程的影响6.6 MIL-C发酵液的脱色过程6.6.1 MIL-C发酵液中色素标准曲线6.6.2 脱色树脂的筛选6.6.3 pH值对脱色效果的影响6.7 MIL-C粗产品的精制过程6.7.1 C18填料柱层析6.7.2 CM650离子交换层析6.8 本章小结第七章 MIL-C的结构验证、生物活性和毒理学评价7.1 引言7.2 MIL-C的结构验证7.2.1 MIL-C理化性质7.2.2 MIL-C的HPLC分析7.2.3 MIL-C薄层层析测定7.2.4 全波段扫描7.2.5 1H-NMR图谱7.2.6 ESI图谱7.3 MIL-C的活性分析7.3.1 MIL-C体外活性评价7.3.2 MIL-C盆栽实验7.3.3 MIL-C田间小区实验7.4 MIL-C的毒理学研究7.5 本章小结第八章 米多霉素类化合物的CADD模拟研究8.1 引言8.2 方法8.2.1 米多霉素类化合物的低能构象和能场分布8.2.2 米多霉素类化合物的结构模拟8.2.3 米多霉素类化合物的抗菌基团预测8.3 结果与讨论8.3.1 米多霉素类化合物的低能构象和相关参数分析8.3.2 米多霉素类化合物的结构模拟8.4 米多霉素类化合物抗菌活性药效团预测8.5 本章小结第九章 结论与展望9.1 实验结论9.2 展望参考文献博士期间己发表录用的文章附图一 MIL-F核磁共振氢谱附图二 MIL-F电喷雾-阳离子质谱附图三 MIL-C核磁共振氢谱附图四 MIL-C电喷雾-阳离子质谱
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