固定化超氧化物歧化酶的制备与性质研究

论文摘要

固定化酶作为现代生物工程技术的重要组成部分之一,在医学、分析与分离技术以及化学合成等领域有着广泛的用途。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase.简称SOD）是美国科学家Mccord和Fridovich1969年从牛血红细胞中发现的一种含有金属离子的酶,也是至今为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。该酶能专一的清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基（O2.ˉ）,在维护生物机体内自由基产生与清除的动态平衡过程中起着极其重要的作用。本课题制备了固定化超氧化物歧化酶,测定了固定化酶的活力,并对其理化性质进行了系统的研究。一、固定化超氧化物歧化酶的制备及活力测定本课题通过对甲壳素的去乙酰化制备并纯化壳聚糖,将壳聚糖与一定浓度的戊二醛混合交联,使其发生氨醛缩合生成活化的载体,将超氧化物歧化酶与活化的载体混合搅拌后抽滤并洗涤,放置于4℃冰箱保存待用。以改进的邻苯三酚自氧化法为测定酶活力的方法。固定化超氧化物歧化酶活性可达到333U.g-1,酶活回收率为86.32%二、酶活力测定的两种方法比较测定超氧化物歧化酶的活力,常采用经典的邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应,生成中间产物红桔酚,同时生成O2.ˉ。邻苯三酚的自氧化率随着超氧阴离子O2.ˉ浓度的增加而增大。SOD能催化O2.ˉ发生歧化反应,生成H2O2和O2.ˉ,从而抑制邻苯三酚的自氧化。样品对邻苯三酚的抑制程度,可反映样品中SOD的含量。本课题采用以维生素C为终止剂的邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性。经研究,维生素C的加入,使原本持续的反应得以终止,为同时测定多组实验项数据提供了条件。而且本法相比较经典的邻苯三酚自氧化法,不存在统计学差异。三、固定化超氧化物歧化酶的理化性质测定本课题对固定化超氧化物歧化酶的贮存稳定性、pH稳定性与温度稳定性进行了研究,每天测定一次酶活力,得到其活力变化曲线,经测算,半衰期为43.8天;分别在各种pH条件下测定酶的活力,结果固定化酶在pH6时活性最强;在各温度下测定酶活力,结果表明固定化酶的最适反应温度为45℃。固定化酶使用一次后回收,测得活力为初始的70.12%,使用两次后回收,测得活力为51.72%四、固定化超氧化物歧化酶的动力学研究本课题在国内首次对固定化超氧化物歧化酶进行了动力学研究,测定了固定化超氧化物歧化酶与溶液酶的米氏常数。固定化酶和溶液酶的米氏常数（Km）分别为0.18mmol/L和0.16mmol/L。固定化酶的Km略低于溶液酶,说明固定化处理影响了酶对底物的亲和力,使酶的活力降低了。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 第一章 固定化超氧化物歧化酶的制备与活力研究
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 实验原理
• 1.3 固定化酶的制备
• 1.4 实验结果
• 1.4.1 固定化反应pH 值对固定化酶活力的影响
• 1.4.2 固定化反应戊二醛浓度对固定化酶活力的影响
• 1.4.3 固定化给酶量对固定化酶活力的影响
• 1.4.4 活力回收
• 1.5 酶活性测定的方法比较结果
• 1.5.1 经典邻苯三酚自氧化法实验结果
• 1.5.2 改进的邻苯三酚自氧化法实验结果
• 第二章 固定化酶性质研究
• 2.1 固定化酶的最佳反应pH 值
• 2.2 固定化酶的最佳反应温度
• 2.3 较高温度对固定化酶活力的影响
• 2.4 溶液酶和固定化酶的稳定性
• 2.5 固定化酶的半衰期
• 2.6 酶在强酸碱条件下的稳定性
• 2.7 重复使用对固定化酶活力的影响
• 2.8 讨论
• 第三章 固定化超氧化物歧化酶的动力学研究
• 3.1 试剂与仪器
• 3.2 实验原理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 反应时间的确定
• 3.3.2 米氏常数的测定
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 综述
• 致谢