叶籽银杏matK和ITS序列分析及系统发育研究

论文摘要

银杏(Ginkgo biloba L.)系第四纪冰川之后惟一在中国保存下来的一孑遗种子植物。在其漫长的演化历程中,银杏的种子和叶片发生了明显的形态变异。1891年,Shirai在日本发现了世界上第一株叶籽银杏(Ginkgo biloba L. var. epiphylla Mak.)。作为银杏家族中的特异种质,叶籽银杏具有重要的观赏价值和科研价值。然而,目前对叶籽银杏的研究主要集中在形态的简单观察和描述,国内外学者对叶籽银杏的分类地位及系统进化尚无定论。因此,迫切需要利用分子生物技术探讨叶籽银杏的变异机制。本研究以2株银杏和来自中国和日本的27株叶籽银杏为试材,对其叶绿体matK基因序列和ITS序列进行了分析,并构建了matK基因序列系统发育树。主要研究结果如下:(1)利用改良的CTAB法提取了叶籽银杏基因组DNA。经电泳检测,片段大小在23kb左右,DNA带整齐清晰,没有明显拖尾,表明该法可以获得高纯度的DNA。(2)克隆测得的27个叶籽银杏样品的matK基因序列全长为1539bp。序列分析结果表明,序列T碱基含量最高,其中‘牛山2#’(NS2)最大,‘洞口’(DK)最小;T、C、A、G四种碱基的平均含量分别为33.84%、18.75%、28.7%、18.73%。叶籽银杏cpDNA matK基因序列富含A/T。叶籽银杏matK基因密码子3个位点的T碱基含量均最高,平均分别为30.17%、31.37%和39.97%;3个位点中,第1位点的G和C含量最高,第3位点G和C含量最低,主要是因为其T含量较高。叶籽银杏matK基因序列密码子第1、2和3位的变异比为1.24:1.07:1,3个位点没有严重的偏离,其变异位点主要分布在序列的5’端。该基因共编码512个氨基酸,氨基酸变异位点也主要发生在5’端。基因各样品的GC含量与密码子3个位上的GC含量线性相关斜率接近于0,说明3个位点受到的突变压作用相同。基于matK基因序列各样品间K2p遗传距离为0~0.0079。matK基因序列构建的系统发育树,树长为1064步,一致性指数(CI)为0.9803,保持性指数(RI)为0.7640。来自不同地域的叶籽银杏样品均处于同一分支,表明叶籽银杏为同一起源;与银杏相比,叶籽银杏样品处于系统发育树的基部,反映出叶籽银杏的原始性。(3)测得的27个叶籽银杏样品的ITS序列全长均为1224bp。序列分析结果表明,序列G碱基含量最高,其中‘洞口’(DK)最大,‘YZ6’最小;T、C、A、G四种碱基的平均含量分别为18.6%、33.7%、13.6%和34.2%。叶籽银杏ITS序列富含G/C。叶籽银杏ITS序列包括ITS1、5.8S rDNA和ITS23个区段,其长度分别为822bp、161bp和241bp。ITS1序列G碱基含量最高,其中‘牛山1#’(NS1)最大,‘YZ7’最小;ITS2序列碱基C含量最高,其中‘牛山2#’(NS2)最大,‘YZ6’和‘广西3#’(GC3)最小。叶籽银杏ITS1和ITS2序列各碱基含量存在较大差异。叶籽银杏ITS序列变异位点主要分布在ITS1区,5.8S rDNA和ITS2区较为保守。基于ITS序列各样品间K2遗传距离为0~0.0099。银杏和叶籽银杏ITS序列共含有57个变异位点,但仅有2个信息位点,如此少的信息位点使它不能提供足够的信息进行系统发育树的构建。本文对叶籽银杏的分类地位、系统发育和发生机理进行了探讨。该研究对叶籽银杏和裸子植物系统发育及分子进化的理解及叶籽银杏这一观赏资源的保护、利用和开发具有重要意义。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1. 引言
• 1.1 银杏的起源和演化
• 1.2 银杏的种下分类
• 1.3 叶籽银杏研究概述
• 1.3.1 叶籽银杏的分布
• 1.3.2 叶籽银杏的形态学与生物学特性研究
• 1.3.3 叶籽银杏的细胞和分子生物学研究
• 1.4 MATK 基因特点及其应用
• 1.5 ITS 序列特点及其应用
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 实验地概况
• 2.2 实验材料、仪器及试剂
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 试剂配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 基因组DNA 的提取
• 2.3.2 PCR 引物的设计
• 2.3.2.1 MATK 基因序列扩增引物
• 2.3.2.2 ITS 序列扩增引物
• 2.3.3 PCR 反应体系和反应程序
• 2.3.3.1 MATK 基因序列PCR 反应体系和反应程序
• 2.3.3.2 ITS 序列PCR 反应体系和反应程序
• 2.3.4 PCR 产物的回收与纯化
• 2.3.5 DNA 片段的连接
• 2.3.6 E.COLI 感受态细胞的制备（CACL2法）
• 2.3.7 质粒的转化
• 2.3.8 阳性克隆鉴定及序列测定
• 2.3.9 序列分析及系统发育树构建
• 3. 结果与分析
• 3.1 叶籽银杏基因组DNA 的提取
• 3.1.1 DNA 的提取
• 3.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2 PCR 扩增结果
• 3.2.1 MATK 基因序列扩增结果
• 3.2.2 ITS 序列扩增结果
• 3.3 阳性克隆鉴定结果
• 3.3.1 MATK 基因序列阳性克隆鉴定结果
• 3.3.2 ITS 序列阳性克隆鉴定结果
• 3.4 序列测定结果
• 3.4.1 MATK 基因序列测定结果
• 3.4.2 ITS 序列测定结果
• 3.5 序列分析
• 3.5.1 序列碱基组成分析
• 3.5.1.1 MATK 基因序列碱基组成分析
• 3.5.1.2 ITS 序列碱基组成分析
• 3.5.2 序列变异特点分析
• 3.5.2.1 MATK 基因序列变异特点分析
• 3.5.2.2 ITS 基因序列变异特点分析
• 3.5.3 MATK 基因编码特征及氨基酸变异特点分析
• 3.5.4 遗传距离及核苷酸差异分析
• 3.5.4.1 基于MATK 基因各样品间的遗传距离及核苷酸差异
• 3.5.4.2 基于ITS 序列各样品间的遗传距离及核苷酸差异
• 3.5.5 系统发育分析
• 3.5.5.1 MATK 基因系统发育分析
• 3.5.5.2 ITS 序列系统发育分析
• 4. 讨论
• 4.1 叶籽银杏基因组DNA 的提取
• 4.2 叶籽银杏MATK 和ITS 序列特点
• 4.3 叶籽银杏的分类地位
• 4.4 叶籽银杏亲缘关系的探讨
• 4.5 叶籽银杏的发生机制
• 5. 结论
• 5.1 叶籽银杏基因组DNA 的提取
• 5.2 叶籽银杏MATK 基因序列分析
• 5.3 叶籽银杏ITS 序列分析
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况