周焕城彭广福宋越张彩云温治强徐继威肖胜兵李嘉
(广东省梅州市人民医院514000)
【摘要】目的：探讨LSF促进肝癌细胞生长及具体的分子机制。方法：1、构建真核表达质粒pcDNA-3-HA-LSF，2、质粒转染肝癌细胞HepG2,通过Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭力的改变，3、通过RT-PCR、westernblot实验观察骨桥蛋白（OPN）的变化。结果：1、成功构建质粒pcDNA-3-HA-LSF，2、转染质粒pcDNA-3-HA-LSF后，HepG2细胞的侵袭力增强，3、转染质粒pcDNA-3-HA-LSF后，OPN的mRNA和蛋白水平显著提高。结论：LSF通过上调OPN，促进肝癌细胞的侵袭和转移。
【关键词】肝癌LSF骨桥蛋白Matrigel侵袭肿瘤侵袭
【中图分类号】R730【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）03-0031-02
原发性肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，不仅它的发病率居于世界恶性肿瘤的第五位，位于中国恶性肿瘤的第二位。同时它的死亡率也位于世界恶性肿瘤的第四位[1]。但是目前对于HCC的发病机制尚不完全清楚，因此，给临床治疗带来了相当的困难[2]。晚SV-40转录因子LSF（LateSV40Factor），属于LSF家族，普遍存在于各物种体内，是细胞周期中G1/S过渡所必需的[3]。LSF蛋白的表达水平在癌细胞中异常升高，尤其在HCC细胞系中。LSF是一种转录因子，研究发现骨桥蛋白直接受到LSF的调控。骨桥蛋白OPN通过刺激细胞信号转导促进肿瘤恶性发展并能加强转移性细胞的生存[4]。本实验探讨LSF促进肝癌细胞侵袭转移的分子机制，为肝癌细胞的治疗提供新的靶点。
1实验材料与方法
1.1实验材料：
真核表达质粒pcDNA3来自本实验室，LSF的cDNA购自SantaCruze，标签蛋白HA、蛋白OPN的抗体均购自Abcam，转染试剂Lipo2000购自Invitrogen，人肝癌细胞SMMC-7721购自中科院细胞库。
1.2细胞的培养与转染
按照ATCC的方法培养细胞。人肝癌细胞SMMC-7721于含10%胎牛血清的DMEM中培养，培养条件为5%CO2，37℃恒温培养箱，2-3天传代一次。
按照Invitrogen的转染试剂Lipo2000的操作说明书，进行细胞的转染。本研究的实验处理为：对照组即不做任何处理的肝癌细胞SMMC-7721组，Mock组即转染空载质粒pcDNA3的细胞组，实验组即转染重组质粒pcDNA3-HA-LSF的细胞组
1.3WesternBlot实验检测细胞内LSF的表达
将对数生长期的肿瘤细胞以5×106/孔的密度分别接种于6孔板中，每孔2ml培液，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。分别按照实验设计的处理分组，转染细胞24h后，用蛋白裂解液处理细胞，收集蛋白样品。将蛋白样品用BCA蛋白定量试剂盒定量后，每孔加入50μg的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转到PVDF膜上。5%的脱脂奶粉封闭1h,加一抗Actin（1：1000稀释）、OPN(1：1000稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗膜10min×3次后，加荧光二抗（1：3000）稀释，室温1h，TBST洗膜10min×3，ECL发光检测LSF的表达。
1.4TransWell侵袭实验
将侵袭实验需用的8um孔径的TransWell特制小杯，置于24孔板中，将对数生长期的肿瘤细胞以1×105/孔的密度分别接种于24孔板中，然后加500ulDMEM+0.1%BSA的新鲜培养液。置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。分别按照实验设计的处理分组，培养15h后，取出侵袭的小杯，PBS冲洗后，用棉花棒刮去杯底部膜杯内的细胞，而在膜杯外的细胞即为穿过膜的细胞，用95%乙醇固定10min，0.2%的结晶紫染色，PBS冲洗，风干后镜检，镜下选择6个视野计数并统计求平均值，拍照。
1.5OPN基因的RT-PCR检测
根据RT-PCR引物设计的数据库，上游：5-CCTTGACGCCGATTTAGCGTC-3,下游:5-CCGTACCGATTAGCGAACTAGCTAGC-3。根据实验设计的不同分组，分别对细胞进行不同的处理。转染24h后，提取细胞中的RNA，然后逆转录为相应的cDNA序列，根据设计的引物，检测OPN的mRNA表达水平。
1.6WesternBlot实验检测细胞内OPN的表达
将对数生长期的肿瘤细胞以5×106/孔的密度分别接种于6孔板中，每孔2ml培液，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。分别按照实验设计的处理分组，转染细胞24h后，用蛋白裂解液处理细胞，收集蛋白样品。将蛋白样品用BCA蛋白定量试剂盒定量后，每孔加入50μg的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转到PVDF膜上。5%的脱脂奶粉封闭1h,加一抗OPN（1：1000稀释），4℃孵育过夜，TBST洗膜10min×3次后，分别根据一抗的属性，加荧光二抗，室温1h，TBST洗膜10min×3，ECL发光检测OPN的表达。
1.7统计学处理
所有数据均采用Excel2007，所有定量实验均重复3次，各组数据以“均值±标准差”表示。组间比较用t检验，P<0.05代表差别显著。
2实验结果
2.1WesternBlot实验检测细胞内LSF的表达
通过细胞转染和WesternBlot实验验证成功构建真核表达质粒pcDNA-3-HA-LSF，结果如图1所示。
图1WesternBlot检测LSF的蛋白表达水平
1对照组即不做任何处理的肝癌细胞SMMC-7721组
2Mock组即转染空载质粒pcDNA3的细胞组
3实验组即转染重组质粒pcDNA3-HA-LSF的细胞组
2.2TransWell侵袭实验
按照实验的分组处理，Transwell细胞体外运动侵袭试验结果显示,如图2所示，转染LSF的肝癌细胞穿过TransWell聚碳酯膜的数量明显增加(P<0.05)。
图2Transwell细胞体外运动侵袭实验结果
1对照组即不做任何处理的肝癌细胞SMMC-7721组
2Mock组即转染空载质粒pcDNA3的细胞组
3实验组即转染重组质粒pcDNA3-HA-LSF的细胞组
2.3转染细胞的OPN基因的检测
将实验分为对照组即不做任何处理的肝癌细胞SMMC-7721组，Mock组即转染空载质粒pcDNA3的细胞组，实验组即转染重组质粒pcDNA3-HA-LSF的细胞组，通过RT-PCR检测OPN基因的mRNA表达水平。如图1所示，转染重组质粒pcDNA3-OPN后，细胞内的OPN的mRNA表达水平显著增加，而对照组和Mock组的mRNA表达水平不变。通过WesternBlot实验检测细胞内OPN的蛋白表达水平，如图2所示，转染重组质粒pcDNA3-OPN后，细胞内的OPN的蛋白表达量明显上调，而对照组和Mock组的蛋白水平不变。
图3RT-PCR检测OPN的mRNA表达水平
1对照组即不做任何处理的肝癌细胞SMMC-7721组
2Mock组即转染空载质粒pcDNA3的细胞组
3实验组即转染重组质粒pcDNA3-OPN的细胞组
图4WesternBlot检测OPN的蛋白表达水平
1对照组即不做任何处理的肝癌细胞SMMC-7721组
2Mock组即转染空载质粒pcDNA3的细胞组
3实验组即转染重组质粒pcDNA3-OPN的细胞组
讨论
肝癌的发生是由多基因、多因素参与,不同基因在不同时期的表达及功能发生紊乱的复杂过程。目前发现的与肝癌发生、发展有着密切关系的基因还不多，寻找新的肝癌相关基因并深入研究这些基因在肝癌发生、发展过程中的作用,对于阐明肝癌的发病机制以及诊断、预防和治疗均具有重要意义。肝癌复发转移是目前制约肝癌治疗疗效的主要因素[5]。
研究人员在癌症以外的领域研究LSF的作用超过25年，但首次证明了在肝癌中LSF起的重要作用。在4月19在线发表在《PNAS》的研究中，研究人员采用一系列研究来识别一种称为LSF新的肿瘤基因，观察到与健康的个体相比，肝癌患者的LSF水平显著增高6。此外，研究小组发现，LSF在肝癌的发展和进展中起重要作用，抑制LSF能逆转人肝癌细胞的侵袭性。所以本实验选择低侵袭性无转移能力肝癌细胞系SMMC-77217，通过Transwell细胞体外运动侵袭试验，发现转染质粒LSF后，肝癌细胞SMMC-7721穿过TransWell聚碳酯膜的数量明显增加(P<0.05)，说明LSF通过提高肝癌细胞的转移侵袭能力，促进肝癌细胞的生长。LSF是一种转录因子，所以它可以直接调节基因的表达，研究发现骨桥蛋白OPN受LSF的调控。研究发现OPN既是一种分泌型细胞外基质蛋白又是一种细胞因子，能促进细胞的趋化和迁移[7]。OPN与其受体(整合素、CD44v)结合后激活细胞内相应的信号通路引起相应基因表达的改变，促进肿瘤侵袭转移。OPN与肝癌侵袭转移密切相关，但是OPN促进肝癌侵袭转移的机制尚未阐明[8]。本实验里将LSF质粒转染肝癌细胞，OPN表达明显上调。体外功能实验提示细胞侵袭和转移能力明显增强，与空质粒转染细胞相比，差异有显著性。
本实验，通过LSF显示了肝癌的进展的新机制，为我们研究肿瘤进程机制和复杂病因提供了新的见解。由于LSF在患者中有如此增高的比例，因此它可能是一个潜在的干预治疗的靶点。
参考文献
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[4]陈荣新；叶胜龙骨桥蛋白与肿瘤转移的研究进展[J];国际外科学杂志;2006,33(1)
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