果蝇心脏发育候选基因CG3295转基因品系构建及功能研究

论文摘要

RMND5A/B是本实验室克隆的人类心脏发育的候选新基因,其功能研究目前尚未有报道。为了研究人类新基因RMND5A/B在心脏发育过程中的作用,利用生物信息学结合分子生物学技术克隆了人类新基因RMND5A/B在果蝇的同源基因CG3295。生物信息学分析表明,CG3295位于果蝇2号染色体57B9-57B9区段,只包含一个外显子,具有一个转录本,其cDNA全长为1860bp,ORF全长1298bp,编码432个氨基酸。本人提取了野生型成虫果蝇的RNA,反转录成cDNA,设计引物克隆果蝇CG3295基因,将扩增的基因与pMD18-T克隆载体相连,构建成pMD18-T-CG3295质粒,经KpnI和XbaI酶切处理,将pMD18-T-CG3295克隆质粒中的CG3295基因转入pUAST表达载体,构建成pUAST-CG3295重组质粒,将pUAST-CG3295重组质粒和pΔ2-3转座酶质粒共同显微注射野生型白眼果蝇0h-0.5h受精胚胎,在子代通过mini-white标记（橙眼）筛选建立了12个转基因果蝇品系。为了检测每一个转基因品系中CG3295基因的表达情况,将纯合的转基因品系与Twi-GAL4和Act5C-GAL4品系分别杂交,收集子代0h-12h胚胎,提取蛋白并进行Western Blot检测,结果显示在·4号、7号与10号品系中CG3295蛋白的表达有显著增加。为了研究CG3295基因过表达时能否导致心脏突变表型,将10个转基因品系纯合体与Hand-GAL4;Hand-GFP品系杂交,在荧光显微镜下观察杂交后子代的心管和淋巴腺的表型特征,结果显示4号品系出现心管突变表型,其副心肌细胞呈现明显的缺失。总之,本文成功构建了12个CG3295基因转基因果蝇品系,初步分析表明,整合在基因组中的CG3295基因在转基因果蝇品系中能过量表达,在果蝇体内过表达CG3295基因时能导致心脏突变表型,表明CG3295基因与果蝇的心脏发育有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言及文献综述
• 1.1 果蝇模型是遗传学研究的理想模型
• 1.2 果蝇心脏发育的特征
• 1.3 果蝇心脏发育的信号调控
• 1.4 转基因果蝇的构建
• 1.5 本课题的研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 2.1.2 果蝇品系
• 2.1.3 酶与试剂盒
• 2.1.4 菌株和质粒
• 2.1.5 抗体
• 2.1.6 其他试剂
• 2.1.7 主要实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 常用试剂及培养基配制
• 2.2.2 CG3295基因的克隆
• 2.2.3 PUAST-CG3295转基因质粒的构建
• 2.2.4 果蝇胚胎显微注射
• 2.2.5 CG3295转基因果蝇的筛选及纯合体的构建
• 2.2.6 CG3295转基因品系果蝇的PCR检测
• 2.2.7 CG3295转基因果蝇蛋白表达检测
• 2.2.8 CG3295转基因果蝇心管表型观察
• 第三章 结果
• 3.1 基因CG3295在果蝇中的基本表达情况
• 3.2 CG3295基因的克隆
• 3.3 CG3295重组质粒的构建
• 3.4 果蝇胚胎的显微注射
• 3.5 CG3295转基因果蝇的筛选及纯合体的构建
• 3.6 转基因果蝇的PCR检验
• 3.6.1 转基因果蝇基因组的提取
• 3.6.2 RT-PCR
• 3.7 转基因果蝇蛋白表达检测
• 3.8 转基因果蝇心管表型观察
• 第四章 讨论
• 4.1 实验仪器变更
• 4.2 实验方法改进
• 4.3 GAL4启动子品系的更换
• 4.4 CG3295基因对果蝇心脏发育的影响及其潜在的功能
• 第五章 其他工作
• 5.1 CG8419P因子敲除品系构建
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 果蝇杂交程序
• 5.1.3 CG8419P因子敲除品系建立及分析
• 5.2 果蝇心脏发育标记基因ODD多克隆抗体制备
• 5.2.1 ODD基因背景
• 5.2.2 材料与方法
• 5.2.3 结果
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 后记