苏云金芽胞杆菌几丁质酶活性研究

论文摘要

几丁质是自然界储量第二的天然高聚物,几丁质酶是降解其的主要酶类。Bt是应用最成功的杀虫微生物,几丁质酶对Bt杀虫有增效作用。本研究以筛选到的具有较高几丁质水解能力的Bt菌株BRC-Bt1为试验材料,克隆表达该菌株的2个几丁质酶基因,对这2种几丁质酶的结构域组成、催化反应机制、表达调控以及水解产物的生物活性进行了系统研究。BRC-Bt1菌株的chi74基因和目前已发现的Bt 70kDa几丁质酶在核酸序列上高度同源,该酶属18家族几丁质酶,由信号肽、催化区、FN3和ChBD等4个结构域组成,理论分子量74kDa,pI5.77。chi74基因和GST融合在E. coli表达产物为胞内可溶性蛋白,含chi74基因的E. coli细胞能在胶体几丁质平板产生水解圈。以胶体几丁质为底物,Chi74蛋白最适反应温度60℃、pH5,在20-80℃和pH4-8都有活性。Na<sup>+、K<sup>+、NO3-、Cl-不影响该酶活性;Mg2+和SO42-对该酶有激活作用,其中6mmol/L浓度Mg2+提高酶活力约40%,而SO42-在0-3mmol/L浓度范围能提高酶活性,3mmol/L时,提高酶活力约20%,之后再增加浓度激活作用反而下降;Cu2+、Ag+都抑制酶活性。HPLC分析水解产物表明该酶能水解胶体几丁质形成GlcNAc、几丁二糖以及聚合度更高的几丁寡糖,随着反应时间的延长,GlcNAc占产物的比例不断提高。该酶为内切几丁质酶。构建chi74基因不同截短酶基因chiA、chiAF、chiAC,三个截短基因编码的蛋白产物理论分子量和pI分别为:54kDa、6.04,63kDa、6.07和66kDa、5.74。三个截短基因GST融合在E. coli细胞表达产物ChiA、ChiAF、ChiAC水解胶体几丁质的活性分别是野生酶的81%、72%、39%。3种截短酶最适反应温度都是60℃,且温度变化对酶活性的影响和Chi74类似。Mg2+能激活3种截短酶,且激活效率比Chi74高,6.0mmol/L的Mg2+对ChiA、ChiAF、ChiAC分别提高酶活力85%、62%、60%。低浓度的Ag+对3种截短酶活性抑制也比野生酶显著,500μmol/L的Ag+对ChiAC、ChiAF、ChiA等3种截短酶活力分别为70.0%、63.2%、55.0%。截短酶的水解产物HPLC结果表明,Chi74的C端不同片段缺失,胶体几丁质水解不彻底,产物中GlcNAc含量不高,而几丁寡糖含量高。截短酶与Chi74催化活性的差异,表明FN3和ChBD对Chi74水解胶体几丁质很重要。克隆chi36基因,推导蛋白分子量40kDa,pI6.52。该基因与Bt、Bc、Ba上发现的编码36kDa大小的几丁质酶基因同源性很高,而与chi74没有同源性。该酶也属于18家族几丁质酶,只有信号肽和催化区。chi36基因和GST融合表达产物,以胶体几丁质为底物,最适合反应温度55℃、pH5,在30-80℃、pH4-8都有活性。Na+、K+、Mg2+、NO3-、Cl-对该酶活性基本没有影响;低浓度的SO42-对该酶有激活作用;Cu2+、Fe3+、Ag+则抑制该酶活性。Chi36水解胶体几丁质产物HPLC结果表明:该酶是内切几丁质酶,产物中GlcNAc含量低,多种几丁寡糖含量较高。从水解产物可以看出,Chi36水解胶体几丁质的机制和Chi74不同,而且Chi36水解的效率也不如Chi74。等体积混合Chi36和Chi74,催化活性协同提高。用来自chi74的3个C端片段（ChBD、FN3、ChBD+FN3）添加到chi36基因的C端构建3种加长酶基因chi36F、chi36C、chi36FC,预测分子量分别为49kDa、52kDa、60kDa。加长酶基因和GST融合表达产物Chi36F、Chi36C、Chi36FC几丁质酶活性分别比野生Chi36提高7%、21%、33%,最适合反应温度仍是55℃。Ag+对3种加长酶活性抑制率比Chi36低,500μmol/L时,Chi36F、Chi36C、ChiFC加长酶活力分别保留为64.0%、66.0%、70.5%。加长酶水解胶体几丁质产物组成与Chi36类似,且产物中各个组分的浓度都提高,表明加长酶对底物的亲和力增强,进一步说明ChBD、FN3在催化反应中发挥作用,且ChBD比FN3更重要。分别克隆6株Bt菌株chi74和chi36基因上游序列,序列功能分析结果表明,这两个基因都是独立表达的,且两个基因在Bt基因组距离很远。两个基因上游的启动子没有同源性,表明Bt的两个几丁质酶基因的表达调控方式不同。chi74和chi36基因启动子分析结果表明:chi74基因上游有多个潜在启动子,且不同菌株这些启动子的同源性较高,而在chi36上游发现的启动子较少,且菌株间的差异较大。6个菌株都在基因上游发现CAP/CRP位点、NIT-2等多种转录因子结合位点。产几丁质酶培养基和LB培养的BRC-Bt1菌株发酵液上清对香蕉炭疽菌生长有抑制作用,且产酶培养基上清的抑制率更高,抑制率分别为42.8%、27.4%。产酶培养基发酵的上清还能抑制稻瘟病菌丝生长和孢子萌发。E. coli表达的Chi74和Chi36蛋白混合,分别以浓度10mg/mL和5mg/mL作用于松材线虫,24h死亡率分别为87.5%、54.5%。以胶体几丁质为底物,混合酶解反应不同时间的产物对松材线虫的致死情况差异较大,其中酶解8h的产物对松材线虫的毒杀作用最好,平均死亡率为100%。1h、3h的水解产物处理松材线虫的死亡率分别为23.8%、69.3%,而处理时间长达24h的产物对线虫几乎没有毒杀作用,致死率仅为8.4%。此外,酶解产物对肝癌细胞SMMC-7721的生长有抑制作用,IC50为69μg/ml,而对正常肝细胞活性无影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽孢杆菌
• 1.2 几丁质
• 1.3 几丁质酶
• 1.3.1 微生物来源的几丁质酶
• 1.3.2 几丁质酶的结构域
• 1.3.3 几丁质酶的空间结构
• 1.4 微生物几丁质降解系统
• 1.4.1 Serratia marcescens 几丁质降解系统
• 1.4.2 Bacillus circulans WL-12 几丁质降解系统
• 1.5 几丁质酶的生物活性应用
• 1.5.1 真菌病害防治
• 1.5.2 害虫防治
• 1.5.3 医疗卫生
• 1.5.4 几丁寡糖的生物活性
• 1.6 苏云金芽孢杆菌几丁质酶
• 1.6.1 几丁质酶的基因克隆和酶学特征
• 1.6.2 几丁质酶对Bt 杀虫的作用
• 1.6.3 Bt 几丁质酶的抑菌作用
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 Bt 菌株的生理生化实验
• 2.2.2 Bt 总DNA 的提取
• 2.2.3 PCR 扩增
• 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.5 PCR 产物的回收
• 2.2.6 克隆重组质粒的构建
• 2.2.7 E.coli 感受态制备
• 2.2.8 转化和筛选
• 2.2.9 质粒提取
• 2.2.10 DNA 测序
• 2.2.11 生物信息学分析软件
• 2.2.12 切胶回收
• 2.2.13 去磷酸化处理
• 2.2.14 表达重组质粒的构建
• 2.2.15 目的蛋白的诱导
• 2.2.16 细胞破碎
• 2.2.17 蛋白浓度的测定
• 2.2.18 表达蛋白的 SDS-PAGE 检测
• 2.2.19 胶体几丁质的制备
• 2.2.20 几丁质酶活性检测
• 2.2.21 酶学特性分析
• 2.2.22 水解产物的HPLC 分析
• 2.2.23 抑菌实验
• 2.2.24 线虫生测
• 2.2.25 抗肿瘤试验
• 3 结果与分析
• 3.1 Bt 几丁质酶基因chi74 的克隆表达和活性分析
• 3.1.1 BRC-Bt1 菌株几丁质酶活性筛选
• 3.1.2 几丁质酶基因chi74 的克隆
• 3.1.3 生物信息学分析
• 3.1.4 Chi74 蛋白的融合表达
• 3.1.5 影响几丁质酶 Chi74 催化活性的因素
• 3.1.6 酶解产物的 HPLC 分析
• 3.2 Bt 几丁质酶基因chi74 的分段表达
• 3.2.1 不同截短chi74 基因的构建
• 3.2.2 不同截短chi74 基因的融合表达
• 3.2.3 不同截短基因产物的活性分析
• 3.2.4 水解产物的 HPLC 分析
• 3.3 Bt 几丁质酶基因chi36 的克隆表达和活性分析
• 3.3.1 几丁质酶基因chi36 的克隆
• 3.3.2 生物信息学分析
• 3.3.3 融合蛋白的诱导表达
• 3.3.4 影响几丁质酶 Chi36 催化活性的因素
• 3.3.5 几丁质酶 Chi36 水解产物分析
• 3.3.6 Chi36 蛋白与 Chi74 蛋白混合的协同酶解分析
• 3.4 Bt 几丁质酶基因chi36 的改造
• 3.4.1 FN3 区片的克隆
• 3.4.2 FC 区的克隆
• 3.4.3 不同加长chi36 基因的构建
• 3.4.4 不同加长chi36 基因的表达
• 3.4.5 不同加长酶产物的活性分析
• 3.4.6 水解产物的 HPLC 分析
• 3.5 几丁质酶基因chi74 和chi36 上游调控序列的分析
• 3.5.1 6株Bt的生理生化特性
• 3.5.2 6 株Bt 菌株在LB 培养基的产几丁质酶情况
• 3.5.3 chi74 基因上游调控序列分析
• 3.5.4 chi36 基因上游调控序列分析
• 3.6 几丁质酶的生物活性
• 3.6.1 BRC-Bt1不同培养条件发酵液对香蕉炭疽的作用
• 3.6.2 BRC-Bt1 发酵上清对稻瘟病菌的作用
• 3.6.3 Bt 对松材线虫的生测
• 3.6.4 Bt 几丁质酶水解产物的抑癌活性
• 4 讨论
• 4.1 Bt 几丁质酶Chi74 的催化特性
• 4.2 Chi74 不同截短酶的催化特性
• 4.3 Bt 几丁质酶Chi36 的催化特性
• 4.4 不同Chi36 加长酶的催化特性
• 4.5 Bt 几丁质酶基因的转录调控
• 4.6 Bt 几丁质酶及其酶解产物的生物活性
• 参考文献
• 附录 1 chi74 基因测序结果
• 附录 2 chi36 基因测序结果
• 附录 3 chi74 基因上游测序结果
• 附录 4 chi36 基因上游测序结果
• 附录5 博士研究生期间发表及投稿的论文
• 致谢