热处理、UVB辐射后HSP72和P53的变化对黑素细胞功能影响的实验研究

论文摘要

目的通过检测人表皮黑素细胞在热处理、UVB辐射及二者联合作用后HSP72、P53蛋白与基因表达的变化，初步分析热处理及二者联合作用后黑素细胞功能变化的可能机制，为热治疗白癜风及热联合UVB治疗白癜风提供理论依据。方法（1）黑素细胞原代及传代培养：取新鲜的包皮环切标本，逐步进行组织及细胞分离，经过黑素细胞专用培养基培养2代后获得纯化的黑素细胞。（2）选取3-5代细胞生长至60%-70%融合时，对细胞进行热处理（42℃每天干预1h,连续干预3d），分别在末次处理后4h，6h，24h采用Western印迹技术观察HSP72蛋白的表达及变化趋势；末次处理后6h，12h，24h观察P53蛋白的表达及变化趋势。选取后续实验收集细胞的最佳时间点。（3）将细胞随机分为对照组，热处理组（42℃每天干预1h,连续干预3d），UVB辐射组（50mj/㎝2辐射剂量，连续干预3d），联合作用组（首先42℃干预1h，然后50mj/㎝2UVB辐射，连续3d）。（4）根据（2）中得到的蛋白表达的最佳时间点，采用Western印迹和RT-PCR技术分别检测不同组别间HSP72和P53的表达变化。（5） Western印迹结果采用Gene Tools进行灰度值分析。HSP72相对表达量以目的蛋白条带与β-肌动蛋白条带的灰度值之比表示。RT-PCR结果采用2-ΔΔCt法表示，即目的基因相对于对照组基因所改变的倍数，使目的基因归一化，减少由于抽提RNA得率的差异和细胞数引起的误差。实验数据采用Spss13.0进行分析。结果（1）HSP72蛋白在热处理后4h已出现增多6h达到高峰，24h仍有表达，但水平下降；P53蛋白在热处理后6h到24h内呈持续增多趋势。（2）不同组别间HSP72蛋白和mRAN的表达变化：Western印迹结果显示，热处理组（2.022±0.058）及联合作用组（2.080±0.045）HSP72蛋白表达水平明显高于对照组（0.532±0.033，P<0.001）；UVB组（0.546±0.021）与对照组相比表达水平无明显差异（P>0.05）；RT-PCR技术显示，热处理组（6.769±0.895）及联合作用组（7.474±0.467）与对照组（1.000）相比，mRNA表达水平明显增加（P<0.001）；UVB辐射组（0.856±0.086）与对照组相比，mRNA表达水平无明显差异（P>0.05）。析因设计方差分析结果显示热处理与UVB辐射对HSP72蛋白和mRNA表达均无交互作用（F=1.399，2.109，P>0.05）。（3）不同组别间P53蛋白和mRNA的表达变化：Western印迹结果显示热处理组（0.512±0.016）和UVB辐射组（0.554±0.021）P53蛋白表达水平高于对照组（0.316±0.024，P<0.001），联合作用组（0.850±0.020）表达高于单因素处理组；RT-PCR技术显示，热处理组（0.755±0.045），UVB辐射组（0.812±0.186）与对照组（1.000）相比mRNA表达无明显差异（P>0.05），联合作用组mRNA表达（1.173±0.106）上调；析因设计方差分析结果显示热处理与UVB辐射对P53蛋白及mRNA表达有交互作用（F值分别为29.762，23.048,P<0.05）。结论（1）热处理可以引起HSP72和P53蛋白表达增多，分别在末次处理后6h,24h较为显著。（2）热处理组和联合作用组可以引起HSP72蛋白和mRNA表达显著增多，且两组间表达水平类似。UVB辐射后HSP72蛋白和mRNA表达均未增多，所以HSP72表达是热激发的。根据HSP72的作用提示HSP72可能与热处理引起黑素细胞增殖活性增强及UVB辐射后的损伤保护作用有关。（3）热处理组、UVB辐射组及联合作用组与对照组相比P53蛋白表达水平增高，热处理和UVB辐射对P53蛋白表达上调具有协同作用；热处理组、UVB辐射组与对照组相比P53mRNA表达水平未见明显变化，说明单纯热处理或UVB辐射引起P53蛋白上调是转录后水平发生变化，热与UVB联合可以协同使P53mRNA上调。基于P53在黑素形成中的作用，推测热处理后黑素细胞黑素合成增多与UVB类似也是通过P53通路调控的。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 热处理 UVB 辐射后 HSP72 和 P53 的变化对黑素细胞功能影响的实验研究
• 1 引言
• 2 资料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 实验创新及下一步研究方向
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献