川芎嗪促进BKCa通道介导早期糖尿病大鼠血管平滑肌细胞凋亡的研究

论文摘要

糖尿病（DM）是一种多病因的慢性代谢性疾病,糖尿病血管病变（DA）是糖尿病的一个重要并发症,是糖尿病病人各种器官病变的基础。DA可累及各级血管,表现为大血管过早发生动脉粥样硬化,血管舒缩功能障碍,血管平滑肌增生,微循环障碍,微血管瘤形成和微血管基底膜增厚等。在良好的控制血糖水平的基础上,以DA发生发展的机制为切入点,选用药物阻断或减少加重DA发展的病理性因子或产物,成为目前防治DA的新热点。国外从细胞信号转导机制方面研究DA的发病机理,认为高血糖造成血管损伤的可能机制主要有:①多元醇旁路的激活,使代谢产物山梨醇增多,在细胞内积累,引起细胞渗透性损害和肿胀;②蛋白激酶C（PKC）激活,可对血管组织产生一系列不良效应,引起血管的结构与功能改变,与DA及其他糖尿病慢性并发症的发生密切相关;③蛋白质非酶糖化,形成AGEs,使胶原降解减少,基质增加,基底膜增厚,血管壁弹性减低,阻力增加,管腔狭窄;④氧化应激水平升高,对氧化损伤易感性增加,构成糖尿病患者在高血糖时发生慢性血管并发症的基础。西药治疗主要有PKC抑制剂、AGEs形成的抑制剂、醛糖还原酶活性抑制剂、抗氧化剂,上述药物的研发绝大多数还处在实验室阶段,其安全性和有效性还需动物和临床实验进一步证实。现代中医学者认为痰瘀互结是形成DA的主要原因,中医辨证主要分:气阴两虚型和阴阳两虚型;认为痰浊瘀血贯穿于DA发病的始终,活血化瘀,化痰散结是中医治疗DA的一个基本法则。川芎嗪（TMP）是从具有“血中气药”之称的活血化瘀中药川芎中提取出的有效单体,目前在临床上广泛用于治疗兼有血瘀证候的各种疾病,包括DA。血管平滑肌细胞（VSMCs）是构成血管的主要细胞,其增殖导致血管重构,管腔变窄以及血管舒缩调节功能异常,是DA的主要病理改变之一。大电导钙激活钾通道(BKCa)在VSMCs上最为丰富,对平滑肌静息张力的维持和舒缩活动中起重要的调节作用。文献报导TMP可以直接显著增加VSMCs上的BKCa通道开放概率、缩短关闭时间,是TMP扩张血管的重要机制。此外TMP还能抑制体外培养的VSMCs增殖,促进其凋亡,降低抑制凋亡的相关基因c-myc的表达,使VSMCs处于G1期的细胞数显著增多,S期和G2+M期的细胞数显著减少。TMP促进VSMCs凋亡与其开放BKCa通道之间是否存在关联,国内外目前鲜见此方面的研究报道,因此设计了本实验,并试图探讨TMP促进VSMCs凋亡的可能信号转导机制。目的:从整体水平观察TMP对糖尿病早期大鼠胸主动脉VSMCs上BKCa通道的作用,对凋亡相关基因c-myc、Bcl-2、Bax表达的影响;从细胞水平研究TMP对VSMCs增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其促进BKCa通道介导VSMCs凋亡的可能信号转导通路。方法:采用链脲佐菌素（STZ）一次性大剂量腹腔注射,造成大鼠糖尿病模型。将大鼠分为正常对照组、DM模型组、TMP低剂量组、TMP高剂量组。正常对照组和DM模型组均每日腹腔注射注射用水;TMP低、高剂量组分别每日腹腔注射TMP 40mg/Kg,80mg/Kg。连续用药8周后,每组处死部分大鼠,取胸主动脉,采用原位杂交法检测胸主动脉VSMCs上c-myc、Bcl-2、Bax表达。剩余大鼠分批处死,取胸主脉,酶分离法,急性分离出单个血管VSMCs,采用细胞贴附式膜片钳记录模式,记录细胞上BKCa通道的开放电流,平均开放概率（NPo）,平均开放时间（To）、平均关闭时间（Tc）。体外培养胸主动脉VSMCs,PDGF-BB诱导细胞增殖,分别或联合加入TMP和BKCa通道开放剂NS1619,用MTT法检测两药对VSMCs生长的影响;另外对培养的细胞进行分组,分别或联合加入BKCa通道开放剂、阻断剂、一氧化氮供体、p38阻断剂、PKC抑制肽、TMP等,通过Hoechst33342荧光染色,计算VSMCs的凋亡率,经统计学处理后,对比上述药物对VSMCs凋亡的影响。将所有的实验结果进行综合分析,从而推导出TMP通过BKCa通道诱导VSMCs凋亡的可能信号转导通路。结果:1 STZ腹腔注射建立DM大鼠模型的结果60只SD大鼠采用STZ一次性大剂量（55mg/kg）腹腔注射后,有46只成功建立了DM的模型,1只死亡,成模率为76.67%,死亡率为2.17%。2 TMP对VSMCs上凋亡相关基因c-myc、Bcl-2、Bax表达的影响各组间c-myc、Bcl-2、Bax灰度值两两比较有差异（P＜0.01）。正常组的c-myc、Bcl-2、Bax表达最低;TMP低、高剂量组c-myc、Bcl-2表达低于DM模型组（P＜0.01）,Bax的表达高于DM模型组（P＜0.01）;TMP低、高剂量组间比较差异有意义（P＜0.01）。3 TMP对VSMCs BKCa通道活动作用的结果在DM早期,模型组、TMP低、高剂量组BKCa通道平均开放概率显著高于正常对照组、平均关闭时间显著低于正常对照组（P=0.000）。TMP低剂量组和高剂量组的NPo显著高于DM模型组、Tc显著低于DM模型组（P=0.000）,To四组间无差异（P＞0.05）。TMP高剂量组的NPo高于低剂量组,Tc低于低剂量组,组间比较有意义（P=0.000）。4 TMP和BKCa通道开放剂NS1619对体外培养的VSMCs增殖的影响根据OD值计算出VSMCs的存活率,以对照组的细胞存活率为1,经单因素方差分析,模型组的细胞存活率最高＞1,表现为细胞增殖,与其余6组差异明显（P＜0.01）。相对于模型组,各实验组VSMCs的生长均表现为抑制。表明两种药物及其组合用药对PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖有抑制作用。其中NS1619低剂量组、TMP低剂量组和TMP高剂量组抑制VSMCs增殖的作用无差异（P＞0.05）;NS1619高剂量组和混合低、高剂量组比较无差异（P＞0.05）;尽管TMP高剂量组的细胞存活率低于TMP低剂量组,但是两者间的差异无意义（P＞0.05）。NS1619高剂量组和混合低、高剂量组VSMCs的细胞存活率分别为37.34±6.34%、48.93±7.03%、31.13±5.05%,显著低于其他实验组（P＜0.01）,已经表现为较强的细胞的毒性作用。5 BKCa通道介导DM大鼠VSMCs凋亡的信号转导机制实验凋亡率统计结果显示,用低糖（对照组）和高糖培养液（模型组）培养的VSMCs的凋亡率是分别是10.22±0.81%、12.89±2.46%,无差异（P＞0.05）。各实验组与模型组比较:其中NS1619低、高剂量组、TMP组、GSNO和GSNO+paxilline细胞凋亡率显著高于模型组（P＜0.01）;GSNO组凋亡率显著高于NS1619组、TMP组（P＜0.01）,诱导VSMCs凋亡的作用最强;加入BKCa通道阻断剂paxilline后,GSNO组的凋亡率下降明显（P＜0.01）,但仍高于NS1619低、高剂量组、TMP组（P＜0.01）,表明BKCa通道可能作为一个主要的信号转导通路介导了GSNO诱导VSMCs的凋亡;因凋亡率没有完全降至与模型组相同的水平（P＜0.01）,推测GSNO还能通过其他的途径促进VSMCs的凋亡。TMP组的细胞凋亡率与NS1619低剂量组无差异（P＞0.05）;NS1619低剂量组的细胞凋亡率低于高剂量组（P＜0.01）,表明NS1619可剂量依赖性的增加VSMCs的凋亡。有p38阻断剂SB202190和PKC inhibitor peptide参与的实验组（SB202190、SB202190+paxilline、PKC inhibitor peptide、PKC inhibitor peptide+paxilline）VSMCs的凋亡率与模型组比较无差异（P＞0.05）,表明在本实验中对VSMCs的凋亡无影响,paxilline对p38、PKC的信号转导通路也无影响。结论:本实验通过体内体外用药,从整体水平观察到TMP能降低早期DM大鼠胸主动脉上抑制VSMCs凋亡的c-myc、Bcl-2基因表达、增加促进细胞凋亡的Bax基因表达,其作用呈剂量依赖性;DM早期糖尿病大鼠胸主动脉VSMCs上的BKCa通道可以代偿性的增加开放,在此基础上TMP还能通过缩短通道的平均关闭时间,增加VSMCs上BKCa通道开放的概率,TMP的作用呈剂量依赖性。TMP对PDGF-BB诱导的体外培养VSMCs的增殖有一定的抑制作用,并可以通过BKCa通道介导其凋亡。在DM的早期,TMP通过促进BKCa通道活动及其他途径介导了VSMCs的凋亡,可以延缓糖尿病血管重构和DA的病情进展,改善血管的功能,达到防治DA的目的;与NS1619相比TMP防治DA的作用靶点多,安全性好,细胞毒性小,可以长期应用;治疗费用低,适用于我国的国情。TMP通过BKCa通道介导VSMCs凋亡的可能信号转导路径为:1 TMP通过BKCa通道介导VSMCs凋亡信号转导通路1.1 TMP直接激活VSMCs上的BKCa通道开放,钙激活钾电流外流(IK（Ca）增加,细胞内K+流失,K+浓度（[K+]i）下降,一方面导致细胞内容量下降,启动VSMCs凋亡;另一方面升高了Caspase nuclease,启动凋亡,使细胞皱缩,细胞内容量下降。1.2 TMP可以促进eNOS合成,增加NO,通过直接和/或间接的途径开放BKCa通道,达到促进VSMCs凋亡的作用。2 TMP通过非BKCa通道介导VSMCs凋亡的信号转导通路2.1 TMP促进eNOS合成,增加NO,NO作用于线粒体,使线粒体细胞膜去极化,诱导释放细胞色素C（cyt-c）,cyt-c与凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）结合,激活caspase诱导细胞凋亡。在这条通路上,如果Bcl-2与Apaf-1结合,则Apaf-1不能与cyt-c结合,不能激活caspase,不能诱导细胞凋亡。Bax与Bcl-2结合后,Bcl-2就不能与Apaf-1结合,不会影响Apaf-1激活caspas诱导细胞凋亡。2.2 TMP促进eNOS合成,NO增加,NO诱导死亡受体（Fas）,Fas的激活导致神经鞘脂酶的激活,分解神经鞘脂成为酰基神经鞘氨醇;后者激活caspase从而导致胞内蛋白褪变,细胞凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 国内外研究进展
• 1 糖尿病血管病变的国外研究现状
• 1.1 DA的发病机制
• 1.2 DA的药物治疗
• 2 中医对DA的认识
• 2.1 DA的中医病因病机
• 2.2 DA的辩证论治
• 2.4 治疗DA的中药药理研究
• 3 钾通道
• 3.1 钾离子通道的基本结构
• 3.2 钾通道的特征
• 3.3 钾离子通道的分类
• Ca通道'>3.4 血管平滑肌细胞上的钾通道及BK_Ca通道
• 4 川芎嗪的研究进展
• 4.1 实验研究
• 4.2 临床研究
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第一节 糖尿病大鼠模型的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 试剂和仪器
• 1.3 分组和实验方法
• 1.4 观察指标和方法
• 2 结果
• 2.1 一般情况
• 2.2 体重
• 2.3 血糖
• 2.4 DM造模情况
• 3 讨论
• 3.1 造模动物及环境的选择
• 3.2 造模用药及方式
• 3.3 STZ造模的机理
• 3.4 给药途径
• 3.5 STZ的用量
• 3.6 判断成功造模的血糖标准
• 3.7 STZ诱导的DM大鼠模型病情自发缓解的问题
• 3.8 有关缓冲液的问题
• 参考文献
• 第二节 TMP对血管平滑肌细胞c-myc、Bcl-2、Bax的作用
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 造模和分组
• 1.3 给药
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要仪器
• 2 取材
• 3 原位杂交操作程序
• 4 观察指标和方法
• 5 结果
• 6 讨论
• 参考文献
• Ca通道活动的作用'>第三节 TMP对血管平滑肌细胞BK_Ca通道活动的作用
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物的分组
• 1.2 给药
• Ca通道活动'>2 细胞贴附式记录血管平滑肌细胞BK_Ca通道活动
• 2.1 仪器
• 2.2 试剂
• 2.3 单个胸主动脉平滑肌细胞的分离
• 2.4 单通道膜片钳记录
• 2.5 数据分析
• 2.6 数据的统计学处理
• 3 结果
• Ca通道的基本特性'>3.1 BK_Ca通道的基本特性
• Ca通道开放概率、平均开放时间和平均关闭时间的变化'>3.2 各组大鼠胸主动脉平滑肌细胞BK_Ca通道开放概率、平均开放时间和平均关闭时间的变化
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四节 TMP对血管平滑肌细胞增殖的影响及凋亡信号转导实验
• 1 大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞原代培养和鉴定
• 1.1 实验动物
• 1.2 试剂及器材
• 1.3 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的原代培养和鉴定
• 1.4 胸主动脉平滑肌细胞的传代
• 1.5 VSMCs计数
• 1.6 VSMCs冻存
• 2 川芎嗪和NS1619对PDGF-BB诱导大鼠VSMCs增殖的影响
• 2.1 试剂及器材
• 2.2 分组及实验步骤
• 2.3 观察指标
• Ca通道介导DM大鼠VSMCs凋亡的信号转导机制实验'>3 BK_Ca通道介导DM大鼠VSMCs凋亡的信号转导机制实验
• 3.1 试剂及仪器
• 3.2 分组
• 3.3 实验步骤
• 3.4 Hoechst 33342染色原理
• 4 统计学分析
• 5 结果
• 5.1 NS1619和川芎嗪对PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs增殖的影响
• Ca通道介导DM大鼠VSMCs凋亡的信号转导机制'>5.2 BK_Ca通道介导DM大鼠VSMCs凋亡的信号转导机制
• 6 讨论
• Ca通道开放剂与VSMCs增殖'>6.1 BK_Ca通道开放剂与VSMCs增殖
• Ca通道开放剂与VSMCs凋亡'>6.2 BK_Ca通道开放剂与VSMCs凋亡
• 6.3 NO与VSMCs凋亡
• Ca通道的关系'>6.4 NO与BK_Ca通道的关系
• 6.5 川芎嗪与NO的关系
• 参考文献
• 第三部分 结语
• 1 研究结论
• 2 本研究的理论意义和应用价值
• 3 创新点
• 4 存在的问题
• 5 研究展望
• 缩略语
• 附图
• 图1 原位杂交图
• 图2 HOECHST33342染色观察VSMCs凋亡
• 图3 谷-峰样生长的VSMCs
• 图4 VSMCs抗α-actin DAB染色
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢