论文摘要
桉树（Eucalyptus）是世界重要的速生造林树种，桉树焦枯病（Cylindrocladium quinqueseptatum.Morgan）是桉树苗木、幼树的一种世界性病害，其发生区域广，流行性强，危害重，减产幅度大。在采取化学防治收效甚微的情况下，选育抗病种系是防治该病害的一条根本措施，但目前对桉树焦枯病的研究只限于桉树焦枯病病原菌特性和发病规律等方面，而我国引种的桉树资源相当丰富，不同种系桉树对焦枯病的感病程度存在明显差异，但目前这方面均未进行系统的调查、收集和抗病性测定，国内外对桉树焦枯病的抗性机制也未见文献报道。有鉴于此，本研究以经筛选的福建11个桉树主栽种系为研究对象，在对不同桉树种系抗病性进行鉴定基础上分别从形态结构、生理生化和抗病基因角度比较不同抗病类型桉树种系对焦枯病的抗性差异，筛选桉树对焦枯病抗病性早期鉴定的重要形态和生化指标，以期选出优良的抗病种系推广栽培，有效地控制焦枯病的发生。同时利用SSH方法构建桉树响应焦枯病菌侵染的正向差减文库，从分子水平揭示桉树对焦枯病的抗病机制，为今后基因工程培育桉树优良品种提供依据，这对抗病桉树资源的开发利用具有重要理论和实践意义。本研究主要结果如下：（1）供试的11个桉树种系的抗病性存在明显差异。根据桉树不同种系自然条件下的发病率和感病指数将11个种系分为抗病种系：“巨赤桉9224”（13．75）（括号中数字为感病指数，下同）、“尾细桉M1”（15．06）；中抗种系：“巨赤桉201-2”（20．13）、柳桉（20．25）、邓恩桉（22．58）、“巨尾桉广9”（25．00）和“尾巨桉Ug9”（26．25）;中感种系：本沁桉（32．45）、“尾巨桉3229”（38．75）；感病种系：“巨桉3号”（45．00）、“巨桉5号”（52．50）。（2）对不同抗病类型桉树气孔特性与其对焦枯病抗性关系的研究表明：桉树抗病种系上表皮气孔密度明显高于其它种系，各种系下表皮气孔密度明显高于上表皮，下表皮不同抗感种系在气孔大小和气孔密度上与桉树对焦枯病的抗性间不呈规律变化，表明气孔大小、密度与抗病性无关。v（3）对不同抗病类型桉树叶片组织结构与其对焦枯病抗性关系的研究表明：无论上下表皮叶片的蜡质含量和角质层厚与桉树对焦枯病的抗性呈正相关。因此，桉树叶片表面的蜡质和角质是抵抗和延迟病菌侵入的第一结构屏障；桉树抗病种系叶片厚、栅栏组织排列整齐、紧密，而且层数相对较多，海绵组织细胞致密，可以抵抗病菌的侵入和扩展，成为抗病的又一个结构屏障；抗病种系叶绿体数量多，叶片光合作用能力强，积累的淀粉多，抗性也随之增强。据此可以把桉树叶片蜡质含量作为鉴定桉树种系抗性的一种快速手段，桉树叶片厚度、栅栏组织厚度及其细胞排列紧密度作为桉树抗焦枯病的辅助指标。（4）对供试11个桉树种系次生代谢物质与其对焦枯病抗性关系的研究表明：无论健叶还是接种后的病叶，多酚类物质含量、黄酮类化合物含量、多酚氧化酶活性、多酚氧化酶同工酶谱均表现为抗病种系>中抗种系>中感种系>感病种系。接种前抗病种系、中抗种系同工酶谱带活性明显强于中感种系和感病种系：接种后，除感病种系外，其余种系均新增1-2条同工酶谱带。因此，多酚类物质含量、黄酮类化合物含量、多酚氧化酶活性水平及同工酶谱均可作为桉树对焦枯病抗病性的早期鉴定的重要生化指标。（5）对供试11个桉树种系的防御酶与其对焦枯病抗性关系的研究表明：无论健叶还是接种后的病叶，协同完成自由基清除的体内关键防御酶系中的过氧化物酶、超氧岐化酶活力，均表现为抗病种系>中抗种系>中感种系>感病种系。接种前后过氧化物酶同工酶谱带数与的抗病性之间不呈规律性变化，而超氧岐化酶谱带数与抗病性成正比。因此，从抗病育种角度出发可将接种前后桉树过氧化物酶、超氧岐化酶活性的高低和接种后超氧岐化酶同工酶谱带作为桉树对焦枯病抗病性的早期鉴定的生化指标。（6）对供试11个桉树种系的叶绿素特性与其对焦枯病抗性关系的研究表明：接种前桉树体内叶绿素含量和a／b的比值与桉树对抗焦枯病抗性不呈正比；接种后抗病种系体内叶绿素含量和a／b比值下降幅度小，回升的速度快，回升后数值均超过接种前；而感病种系叶绿素含量随接种时间的延长而显著降低，a／b值在接种的中后期出现小幅回升后继续下降。因此，接种后桉树的叶绿素含量和a／b比值的变化率可反映出桉树抗焦枯病能力的大小，可以把它们作为桉树对焦枯病的抗性鉴定的辅助指标。（7）从11个桉树主栽种系中选取抗性最强的“巨赤桉9224”作为材料，利用SSH方法构建“巨赤桉9224”响应焦枯病菌侵染的正向差减文库，从正向SSH-cDNA文库得到928个克隆，通过reverse northern杂交方法筛选文库，获得25个差异表达基因；对这些基因进行测序，将测序获得的25条原始序列去除由SSH引入的接头引物序列后与基因组数据库（NCBI）进行比对获得23个差异表达的基因，其中22个基因功能已知。这些已知基因分别参与光合作用、能量传递、植保素合成、植物生长、植物抗病性反应和信号转导以及蛋白质代谢。初步揭示了焦枯病菌侵染后“巨赤桉9224”的基因表达轮廓。综上所述，桉树叶片表面的蜡质和角质是抵抗和延迟病菌侵入的第一结构屏障，而桉树叶片厚度及叶肉组织细胞排列整齐、紧密，可以抵抗病菌的侵入和扩展，成为抗病的第二结构屏障。当焦枯病菌侵入桉树体后，机体可通过细胞膜上受体识别这一信号，经细胞内信号转导网络成员三磷酸肌醇（IP3）、二酰苷油（DG）和酪氨酸激酶进一步将信号放大，促进体内光合、呼吸作用相关酶的上调表达，增强桉树光合作用能力，累积有机物和能量，为其应激合成防御酶系、抗菌物质和加固细胞壁提供物质保障，进而提高桉树自身的抗病能力。这些形态和生理表现是桉树对焦枯病抗性的主要机制。