三羟基苯甲酸抗肝癌作用及机制研究

论文摘要

肝癌是发生于肝细胞或胆管细胞的恶性肿瘤,为全世界范围内常见、高发恶性肿瘤之一,具有难发现、难诊断、难治疗、发展快和预后差等特点,近年的研究发现肝癌发病率和死亡率有向小年龄组推移的趋势,而且肝癌和其他恶性肿瘤相比,具有更强的耐药性,因此寻找靶点明确、低毒、高效的抗肝癌药物具有重要意义。3,4,5-三羟基苯甲酸（Trihydroxybenzoic acid, TBA）是广泛存在于植物中的多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗诱变及抗肿瘤等多种生物学活性,但其体内、体外抗肝癌作用及作用机制尚未见报道。本研究采用药理学、细胞学和分子生物学技术,体内和体外实验相结合,从整体、细胞与分子水平三个层次,证实TBA的抗肝癌作用并探讨其作用机制。体内实验以H22肝癌细胞荷瘤小鼠为研究对象,TBA不同剂量灌胃给药,观察其对肿瘤生长的抑制作用及对荷瘤小鼠生存时间的影响。体外实验以3种人肝癌细胞株SMMC-7721细胞、HepG2细胞和Bel-7402细胞为研究对象,观察TBA对肝癌细胞生长的抑制作用和诱导凋亡作用并探讨其作用机制。研究结果显示TBA 0.50 g/kg、0.25 g/kg和0.13 g/kg灌胃给药可以不同程度抑制H22肿瘤的生长及延长荷瘤小鼠生存时间。体外实验结果显示TBA对实验中3种肝癌细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性,其中SMMC-7721细胞对TBA的作用最敏感。TBA可以通过增加细胞ROS水平,上调Bax mRNA表达,下调Bcl-2 mRNA表达,降低细胞线粒体膜电位,促进线粒体中细胞色素c释放入胞浆,激活caspase-9、caspase-3蛋白诱导SMMC-7721细胞凋亡实现其抑制肝癌细胞增殖作用。本研究首次证实了TBA的体内和体外抗肝癌作用,为寻找高效低毒的抗肝癌药物的先导化合物和开发新药提供了实验基础和理论依据。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩略语
• 第一章 绪论
• 1. 三羟基苯甲酸抗肿瘤作用研究进展
• 1.1 TBA 的体外抗肿瘤作用
• 1.2 TBA 的体内抗肿瘤作用
• 1.3 TBA 对正常细胞与肿瘤细胞的敏感性
• 1.4 TBA 的安全性
• 1.5 问题与展望
• 2. 细胞凋亡及其信号转导
• 2.1 细胞凋亡的基本特征
• 2.2 细胞凋亡的基本信号转导途径
• 2.2.1 细胞凋亡的线粒体途径
• 2.2.2 细胞凋亡的死亡受体途径
• 2.3 细胞凋亡与肿瘤治疗
• 22肝癌细胞荷瘤小鼠的抑瘤作用和生存时间的影响'>第二章 三羟基苯甲酸对H₂₂肝癌细胞荷瘤小鼠的抑瘤作用和生存时间的影响
• 材料和方法
• 1. 实验材料
• 1.1 动物和瘤株
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2. 实验方法
• 22 肿瘤的抑制作用'>2.1 TBA 对小鼠移植性肝癌H₂₂肿瘤的抑制作用
• 22 肝癌细胞荷瘤小鼠生存时间的影响'>2.2 TBA 对H₂₂肝癌细胞荷瘤小鼠生存时间的影响
• 2.3 统计学分析
• 结果
• 22 肿瘤的抑制作用'>1. TBA 对小鼠移植性H₂₂肿瘤的抑制作用
• 2. 肿瘤组织病理结果
• 22 肝癌细胞荷瘤小鼠生存时间的影响'>3.TBA 对H₂₂肝癌细胞荷瘤小鼠生存时间的影响
• 3.1 各组小鼠一般情况观察
• 3.2 各组小鼠体重变化
• 22 荷瘤小鼠平均生存时间和生命延长率'>3.3 H₂₂荷瘤小鼠平均生存时间和生命延长率
• 讨论
• 第三章 三羟基苯甲酸诱导肝癌SMMC-7721 细胞凋亡的研究
• 材料和方法
• 1. 实验材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 细胞株
• 2. 实验方法
• 2.1 细胞培养及药物配制
• 2.2 MTT 法检测TBA 对人肝癌SMMC-7721 细胞、HepG2 细胞、Bel-7402 细胞生长的抑制作用
• 2.3 MTT 法检测TBA 对PBMC 生长的抑制作用
• 2.4 MTT 法检测TBA 对SMMC-7721 细胞生长抑制作用的时间效应
• 2.5 相差显微镜观察细胞形态
• 2.6 瑞士-姬姆萨染色观察细胞形态
• 2.7 AO 染色检测细胞凋亡
• 2.8 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡
• 2.9 AnnexinV-FITC/PI 双染流式细胞仪检测细胞凋亡
• 2.10 统计学分析
• 结果
• 1. TBA 对肝癌SMMC-7721 细胞、HepG2 细胞、Bel-7402 细胞和PBMC 生长的抑制作用
• 2. TBA 对肝癌SMMC-7721 细胞抑制作用时间效应
• 3. TBA 作用SMMC-7721 细胞的形态学观察
• 4. SMMC-7721 细胞AO 染色结果
• 5. SMMC-7721 细胞DNA 琼脂糖凝胶电泳结果
• 6. Annexin V-FITC/PI 染色流式细胞仪检测结果
• 讨论
• 第四章 三羟基苯甲酸诱导SMMC-7721 细胞凋亡的机制研究
• 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 SMMC-7721 细胞caspase-3 蛋白活性测定
• 2.2 SMMC-7721 细胞caspase-9 蛋白活性测定
• 2.3 SMMC-7721 细胞caspase-8 蛋白活性测定
• 2.4 Rh123 染色流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位[130]
• 2.5 Western blot 检测SMMC-7721 细胞胞浆和线粒体细胞色素c
• 2.6 RT-PCR 检测TBA 对SMMC-7721 细胞Bcl-2 和Bax mRNA 表达的影响
• 2.7 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞内ROS 的变化[132]
• 2.8 统计学分析
• 结果
• 1. TBA 对SMMC-7721 细胞caspase-3 蛋白活性的影响
• 2. TBA 对SMMC-7721 细胞caspase-9 蛋白活性的影响
• 3. TBA 对SMMC-7721 细胞caspase-8 蛋白活性的影响
• 4. TBA 对SMMC-7721 细胞线粒体膜电位的影响
• 5. TBA 对SMMC-7721 细胞胞浆和线粒体细胞色素c 含量的影响
• 6. TBA 对SMMC-7721 细胞Bcl-2 和 Bax mRNA 表达的影响
• 7. TBA 对SMMC-7721 细胞内ROS 的影响
• 讨论
• 1. TBA 抗肝癌作用
• 2. TBA 抗肝癌作用机制
• 结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文及取得的科研成果
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract