论文题目: SARS冠状病毒复制酶蛋白nsp8和nsp9受体蛋白的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 刘家森
导师: 孔宪刚
关键词: 冠状病毒,复制酶,受体
文献来源: 东北农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Sydrome, SARS)是由SARS 冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV)引起的一种新的急性呼吸道传染病。该病以高热、头疼、肌痛酸痛和干咳为主要特征,进程性的呼吸系统衰竭;传播快、范围广、发病急,严重威胁患者生命,死亡率可达到10%。目前,通过传统的方法如快速检测、传染控制、隔离检疫和溯源等已经使SARS 得到控制。但是这些方法不是长久之计,SARS-CoV 的自然发展过程和致病机理必需要阐明,同时还要不断提高诊断方法、设计特异的抗病毒药物和疫苗。SARS-CoV 作为该病的病原体,在入侵肌体后,首先直接以病毒基因组RNA 为翻译模板,表达包括病毒RNA 聚合酶在内一系列多种复制酶蛋白(非结构蛋白),然后利用这些酶通过不连续转录的方式完成负链sgmRNA 的转录合成、各结构蛋白mRNA 的合成,以及病毒基因组RNA 的复制。其自身编码的复制酶蛋白具有多种酶活性:木瓜水解蛋白酶、3C 样胰凝乳蛋白酶、RNA 依赖性聚合酶、解旋酶、3’-5’外切核酸酶、内切核酸酶、2-核糖甲基转移酶等,这些复制酶蛋白在病毒基因组的转录调节、RNA 的复制以及病毒蛋白质的表达调控等多个方面具有重要作用。根据复制酶蛋白功能和结构,人们已经开发出多种抗SARS 冠状病毒的药物来治疗该传染病。目前对于复制酶蛋白中的nsp1、nsp2、nsp4、nsp6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11 的功能尚不清楚。已知在病毒感染细胞后6h,就可以检测到有复制酶蛋白表达,通过荧光显微镜观察nsp8 和nsp9 都分布在细胞核周围以及细胞浆中的内质网和小泡中;并且nsp8 和nsp2、nsp3 形成复合体共同存在于细胞浆中,且和自吞噬小体的标志蛋白(LC3)共同存在。nsp9 具有与RNA 非特异性结合的能力并和nsp8 相互作用,使nsp8 表现出一种具有活性的功能形态。本实验从SARS 冠状病毒(BJ01 株)基因组中经RT-PCR 克隆得到病毒复制酶蛋白nsp8 全长594bp 的基因序列,连接到载体pGEX-6p-1 中,构建原核表达载体pNSP8E,pNSP8E 转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG 诱导表达出可溶性的22kDa 的nsp8 蛋白。通过pull-down试验,利用表达的GST-nsp8 融合蛋白从A549 细胞裂解液中钓取了nsp8 的受体蛋白。肽质量指纹图谱分析表明,nsp8 受体蛋白最可能为锌指蛋白zinc finger protein 324(ZNF324)。以ZNF324 蛋白作为研究对象,从人肺腺癌细胞A549 中,扩增了该蛋白部分片段的基因序列,构建了原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。nsp8 和ZNF324 蛋白间的体外相互作用还需pull-down 实验进一步证明。构建nsp8 的真核表达载体pNSP8,建立转染nsp8 的细胞系。以IgG-anti-nsp8(FITC)作为探针,进行激光扫描共聚焦显微镜观察,nsp8 蛋白分布在细胞浆中;双标法检测初步证实,在细胞内部nsp8 和ZNF324 形成共同的发光点,两者之间存在相互作用,还需进一步通过免疫共沉淀等实验加以证明。从SARS冠状病毒基因组中经RT-PCR克隆得到病毒复制酶蛋白nsp9全长339bp的基因序列,连接到载体pGEX-6p-1 中,构建原核表达载体pNSP9E,pNSP9E 转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG 诱导表达出可溶性的12kDa 的nsp9 蛋白。通过pull-down 试验,利用表达的GST-nsp9 融合蛋白从A549 细胞裂解液中钓取了nsp9 的受体蛋白。经肽质量指纹图谱分析和蛋白质N 末端测序,获得了nsp9 两个受体蛋白的信息。根据肽质量指纹图谱分析,nsp9 受体蛋白之一可能为T cell associated kelch repeat protein(TA-KRP);以TA-KRP 作为研究
论文目录:
中文摘要
英文摘要
1 引言
1.1 严重急性呼吸综合征的病原学
1.1.1 SARS 冠状病毒的形态学和培养特性
1.1.2 SARS 冠状病毒的稳定性和抵抗力
1.1.3 SARS 冠状病毒的起源和变异
1.1.4 SARS 冠状病毒分子生物学研究进展
1.2 SARS 流行病学
1.3 SARS 的临床诊断、病理改变与实验室检测
1.3.1 SARS 临床症状和免疫反应
1.3.2 病理症状
1.3.3 SARS 的诊断
1.4 SARS 的治疗
1.4.1 药物治疗
1.4.2 疫苗的开发和前景
1.5 本课题研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒和细胞
2.1.2 质粒和菌株
2.1.3 其他主要试剂和材料
2.1.4 主要仪器设备
2.2 SARS 冠状病毒复制酶蛋白nsp8 受体蛋白的研究
2.2.1 nsp8 基因的克隆和表达
2.2.2 Pull-Down 实验钓取nsp8 的受体蛋白
2.2.3 受体蛋白ZNF324 的克隆和表达
2.2.4 蛋白体外作用Pull-down 验证试验
2.2.5 荧光抗体的制备
2.2.6 TRITC 标记 IgG-anti-ZNF324 的检测
2.2.7 稳定转染nsp8 细胞系的建立
2.2.8 激光共聚焦显微镜观察分子共存
2.3 SARS 冠状病毒复制酶蛋白nsp9 受体蛋白的研究
2.3.1 nsp9 基因的克隆和表达
2.3.2 Pull-Down 实验钓取nsp9 的受体蛋白
2.3.3 A549 细胞总RNA 的反转录产物合成
2.3.4 受体蛋白TA-KRP 的克隆和表达
2.3.5 受体蛋白BAZ2(ZNF215)的克隆和表达
2.3.6 蛋白体外作用Pull-down 验证试验
2.3.7 荧光抗体的制备
2.3.8 稳定转染nsp9 细胞系的建立
2.3.9 激光共聚焦显微镜观察分子共存
3 实验结果
3.1 SARS 冠状病毒复制酶蛋白nsp8 受体蛋白的研究结果
3.1.1 nsp8 基因的克隆
3.1.2 nsp8 表达和纯化
3.1.3 Western-blotting 鉴定免疫后血清效价
3.1.4 Pull-Down 实验钓取nsp8 的受体蛋白分析结果
3.1.5 ZNF324 部分片段基因的克隆
3.1.6 ZNF324 部分片段的表达结果
3.1.7 蛋白体外作用Pull-down 验证试验结果
3.1.8 TRITC 标记 IgG-anti-ZNF324 的检测结果
3.1.9 nsp8 真核表达载体的构建
3.1.10 nsp8 在转染细胞系中表达的结果
3.1.11 激光共聚焦显微镜观察分子共存的结果
3.2 SARS 冠状病毒复制酶蛋白nsp9 受体蛋白的研究结果
3.2.1 nsp9 基因的克隆
3.2.2 nsp9 的表达和纯化
3.2.3 Western-blotting 鉴定免疫后血清效价
3.2.4 Pull-Down 实验钓取nsp9 的受体蛋白分析结果
3.2.5 TA-KRP 蛋白的基因克隆和表达
3.2.6 BAZ2 蛋白的基因克隆和表达
3.2.7 蛋白体外作用Pull-down 验证试验结果
3.2.8 TRITC 标记 IgG-anti-TA-KRP 和IgG-anti-BAZ2 的检测结果
3.2.9 nsp9 真核表达载体的构建
3.2.10 nsp9 在转染细胞系中表达的结果
3.2.11 激光共聚焦显微镜观察分子共存的结果
4 讨论
4.1 蛋白质测序和肽质量指纹图谱分析的可行性
4.2 锌指蛋白的功能
4.2.1 锌指蛋白的结构
4.2.2 锌指蛋白与核酸、蛋白质之间的作用
4.2.3 锌指蛋白调节基因的转录
4.3 nsp8 和其潜在受体ZNF324
4.4 nsp9 与其潜在受体TA-KRP 和BAZ2
5 结论
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的学术论文
致谢
发布时间: 2005-10-31
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