PiggyBac转座子介导的脂肪代谢相关基因的转基因功能研究

论文摘要

牛肉做为世界消费量第二的肉类食品得到越来越多消费者的青睐。培育出肉质好、营养高的肉牛品种，是育种工作者努力的方向。目前，转基因技术是肉牛改良的重要手段之一，寻找安全、高效的转基因载体及改良作用明显的目的基因成为转基因研究的重要课题。PiggyBac（PB）转座子在转基因昆虫、小鼠等的研究中充分体现了其优势，但在转基因牛中的研究还不多。脂肪酸结合蛋白3（Fatty acid binding protein3，FABP3）是影响肌内脂肪（Intramuscular fat，IMF）沉积的候选基因，fat-1基因编码的ω-3脂肪酸脱氢酶能促进ω-3多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fattyacids，PUFAs）的合成，对人类健康有重要作用。本研究探索了PB转座子在牛基因组中的转座特点，并在小鼠水平对FABP3和Bfat-1（牛源化fat-1）基因进行转基因研究，为生产转基因牛探索新方法、寻找新基因提供了理论依据。本研究共得到如下结果：1．构建了PB[CMV-EGFP]、pcDNA-PBase二元转座体系，利用细胞核电转染技术转染牛耳组织成纤维细胞，发现在转座酶（PBase）存在时，有抗性的阳性克隆明显增多，且转染效率是对照组的9倍。2．利用基因组步移技术检测实验组阳性细胞插入位置的5′旁侧序列，获得了8个有效的插入位点，且有5个位点定位到染色体1、2、11和X染色体上。序列分析发现，PB转座子特异性的插入到“TTAA”位置，且5′端倾向于插入到两个基因间非调控区的GC（62.5％）富集区。3．采用DNA混池测序法，在西门塔尔牛和雪龙黑牛中检测到6个潜在的FABP3基因单核苷酸多态位点（Single nucleotide polymorphism，SNP）。对第1外显子T67C位点的研究发现：该位点与背膘厚、大理石花纹评分及剪切力均不显著相关（P>0.05）。4．通过RT-PCR方法克隆了牛肌肉组织FABP3基因；依据11种牛肌肉蛋白相关基因密码子使用频率对线虫fat-1基因进行密码子优化，获得了牛源化的Bfat-1基因；并利用生物信息学方法对两个候选基因进行了核酸、蛋白结构和功能的分析及预测。5．利用显微注射技术获得了4只FABP3转基因小鼠。分析转基因及野生型小鼠的尿样、血样生化分析结果及全身脂肪组织核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）结果得出：转基因鼠的脂肪酸沉积略有增加，初步确定FABP3基因能够促进脂肪沉积。6．利用尾静脉高压注射法将PB[CMV-EGFP-Bfat-1]质粒注入小鼠体内，Bfat-1基因在小鼠肝脏中瞬时表达，注射24h、48h和72h后，肝脏中18碳和20碳（48h除外）ω-6/ω-3PUFAs比值显著降低（P<0.05），肌肉中仅20碳ω-6/ω-3PUFAs比值有显著降低（P<0.05）。7．利用细胞核电转染方法将PB[CMV-EGFP-FABP3]和pcDNA-PBase环状质粒导入牛胎儿成纤维细胞，经G-418筛选获得了FABP3基因过表达细胞系，为进一步生产FABP3转基因牛提供了实验材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 家畜转基因研究进展
• 1.2.1 转基因技术
• 1.2.2 新兴的转基因技术
• 1.2.3 转基因家畜的应用研究进展
• 1.3 PB 转座子在转基因动物研究中的应用
• 1.3.1 PB 转座子的结构和改造
• 1.3.2 PB 转座子的转座特点及转座机制
• 1.3.3 PB 转座子在转基因动物研究中的应用
• 1.4 绿色荧光蛋白在转基因研究中的应用
• 1.4.1 用于寻找启动子、增强子等调控元件
• 1.4.2 提高转基因的效率及产物的利用率
• 1.4.3 探索不同物种的有效转基因方法
• 1.4.4 生产特殊用途的 GFP 转基因动物
• 1.5 脂肪代谢候选基因功能及研究进展
• 1.5.1 FABP3 基因生物学功能及研究进展
• 1.5.2 fat1 基因功能及研究进展
• 1.6 目的及意义
• 第二章 PB 转座系统在牛耳组织成纤维细胞中的转座
• 2.1 材料
• 2.1.1 动物组织样
• 2.1.2 菌种及质粒
• 2.1.3 试剂及仪器设备
• 2.1.4 主要生物学软件及常用网站
• 2.2 方法
• 2.2.1 牛耳组织成纤维细胞的分离和培养
• 2.2.2 PB 二元共转染系统的的构建
• 2.2.3 细胞转染和药物筛选
• 2.3 结果
• 2.3.1 牛耳组织成纤维细胞的分离、培养
• 2.3.2 PB 二元共转染系统的构建
• 2.3.3 PB 转座子介导外源基因在牛成纤维细胞中的转座
• 2.3.4 PB 转座子在牛基因组中的插入特点
• 2.4 讨论
• 2.4.1 PB 转座系统启动子的改造
• 2.4.2 PB 转座子在牛基因组中的高效整合及整合特点分析
• 2.5 小结
• 第三章 FABP3 和 BFAT-1 基因的克隆及序列分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验群体
• 3.1.2 试验牛性状表型
• 3.1.3 试剂及仪器设备
• 3.1.4 主要生物学软件及常用网址
• 3.2 方法
• 3.2.1 DNA 的提取与检测
• 3.2.2 FABP3 基因多态性与脂肪沉积相关性状的关联分析
• 3.2.3 候选基因的序列分析
• 3.2.4 FABP3 基因的克隆
• 3.2.5 Bfat-1 基因的克隆
• 3.3 结果
• 3.3.1 DNA 和 RNA 的提取结果
• 3.3.2 FABP3 基因多态性分析
• 3.3.3 FABP3 基因的克隆及序列分析
• 3.3.4 Bfat-1 的克隆及序列分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 牛 FABP3 基因的 SNPs 筛查及关联分析
• 3.4.2 Bfat-1 基因密码子优化设计
• 3.4.3 生物信息学在核酸序列和蛋白质序列分析中的应用
• 3.5 小结
• 第四章 FABP3 和 BFAT-1 的转基因功能研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 试验动物
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 质粒载体的构建
• 4.2.2 小鼠尾静脉高压注射
• 4.2.3 组织样品的采集
• 4.2.4 转基因小鼠的制备
• 4.2.5 转基因小鼠核酸水平的鉴定
• 4.2.6 转基因小鼠活体水平的功能分析
• 4.2.7 荧光定量 PCR 鉴定基因的表达水平
• 4.2.8 Western Blot 检测重组蛋白的含量
• 4.2.9 气相色谱法分析各组织样的脂肪酸含量
• 4.3 结果
• 4.3.1 FABP3、Bfat-1 基因表达载体的构建
• 4.3.2 气相色谱条件的优化及标准曲线的绘制
• 4.3.3 FABP3 转基因小鼠的生产及鉴定
• 4.3.4 FABP3 转基因小鼠的功能分析
• 4.3.5 Bfat-1 在小鼠体内的瞬时表达及功能分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 利用转基因鼠研究牛 FABP3 基因的功能
• 4.4.2 小鼠尾静脉高压注射法研究 Bfat-1 基因的功能
• 4.5 小结
• 第五章 FABP3 转基因牛细胞系的建立
• 5.1 材料
• 5.1.1 动物组织样
• 5.1.2 菌种及质粒
• 5.1.3 试剂及仪器设备
• 5.1.4 主要生物学软件及常用网站
• 5.2 方法
• 5.2.1 牛胎儿成纤维细胞的分离培养
• 5.2.2 牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定
• 5.2.3 FABP3 基因表达载体的构建
• 5.2.4 细胞的转染及筛选
• 5.2.5 阳性细胞的鉴定
• 5.3 结果
• 5.3.1 牛胎儿成纤维细胞的分离培养及性别鉴定
• 5.3.2 FABP3 基因转基因牛细胞系的鉴定
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 全文结论
• 6.1 主要结论
• 6.2 创新点
• 6.3 下一步工作
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历