双歧杆菌活的非可培养状态的研究

论文摘要

双歧杆菌为益生菌,主要应用于近年来出现的新型绿色饲料添加剂,它具有无毒副作用,无残留,无抗药性,不污染环境等特点。其主要作用是在数量或种类上补充肠道内减少或缺乏的正常微生物,恢复肠道内的微生态平衡,以达到保健的目的。细菌活的非可培养状态(viable but nonculturable state,VBNC)是细菌处于不良环境条件下的一种特殊存活形式,用常规方法培养不能生长繁殖,但仍然是活的,且具有代谢活性的一种特殊的细菌存活形式,并且这种状态的细菌在适当的条件下可恢复为可培养状态。本试验旨在研究双歧杆菌的VBNC状态,将其引入到益生素的研究之中,为研制新型实用的防病治病的益生菌活菌制剂开辟一条新径。试验对购自中国微生物菌种保藏中心的双歧杆菌进行了活的非可培养状态的初步研究,并且结合多种检测方法,摸索出了双歧杆菌进入非可培养状态的稳定条件,并且对双歧杆菌进行生理生化、16sRNA等检测方法的鉴定,最终证明了用于诱导的细菌确实为双歧杆菌。将双歧杆菌悬浮于液体LB培养基,pH7,置于4℃的低温下厌氧静止培养,双歧杆菌即可进入活的非可培养状态。第15天时双歧杆菌进入活的非可培养状态,维持此状态可至第100天。LB培养基进行诱导比TPY等培养基节省资源,降低成本,且配制简单,使用方便,易于保存。利用双歧杆菌的生理生化性状检测和鉴定双歧杆菌的方法是最早用于检测和鉴定双歧杆菌的方法,也是目前较可信的方法。鉴定结果为所有生理生化反应的指标与双歧杆菌的理论指标完全吻合,可初步确定此细菌为双歧杆菌。细菌的16SrRNA恒定区序列基本保守,所以利用双歧杆菌恒定区序列设计引物将16SrRNA片断扩增出来,并可通过对其序列的分析,其同源性为99.2%,最终判定用于试验的细菌为双歧杆菌。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 细菌VBNC状态的国内外研究现状
• 1.1 可进入VBNC状态的细菌
• 1.2 影响细菌进入VBNC状态的因素
• 1.3 VBNC状态的细菌的生理和生化变化
• 1.4 双歧杆菌生物学特征
• 2 VBNC状态的争议
• 3 细菌VBNC状态细胞的检测
• 3.1 细菌"活细胞"标准的确定
• 3.2 经典方法
• 3.3 分子生物学方法
• 3.4 放射自显影方法
• 3.5 免疫技术检测方法
• 3.6 荧光染料染色直接检测法
• 4 细菌"活的非可培养状态"的研究意义
• 4.1 微生物生态学方面
• 4.2 预防医学及流行病学方面
• 4.3 公共卫生学方面
• 4.4 合理解释了某此现象
• 4.5 活菌数评价方面
• 4.6 菌种保存方面
• 4.7 开发未可培养微生物资源方面
• 5 细菌VBNC状态在动物微生态活菌制剂生产中的应用
• 6 益生菌VBNC状态研究的目的与意义
• 第二章 研究内容
• 试验一 双歧杆菌VBNC状态的诱导与检测
• 1 材料和方法
• 1.1 试验菌株
• 1.2 仪器
• 1.3 试剂
• 1.4 基础培养基
• 1.5 试验装置和方法
• 1.6 诱导条件
• 1.7 细菌VBNC状态诱导条件筛选
• 1.8 细菌计数方法
• 2 诱导因素筛选结果
• 3 讨论
• 3.1 诱导因素的筛选
• 3.2 关于检测方法的选择
• 4 小结
• 试验二 双歧杆菌菌种的鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 试验菌株
• 1.2 仪器
• 1.3 试剂
• 1.4 基础培养基
• 1.5 生理生化方法
• 1.6 PCR方法
• 2 结果
• 2.1 生理生化试验结果
• 2.2 X-Gal培养基法结果
• 2.3 PCR扩增电泳检测结果
• 2.4 重组克隆载体的鉴定
• 3 讨论
• 3.1 关于生理生化试验
• 3.2 关于PCR检测技术中模板DNA的提取与保存
• 3.3 关于试验过程中DNA模板污染的问题
• 3.4 关于PCR检测技术中反应体系与参数的设定
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介