前列腺素E2受体及其G蛋白偶联信号转导在佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞功能中的作用和白芍总苷对其的影响

论文摘要

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以局部和系统性炎症导致关节损伤为特征的慢性自身免疫性疾病,是一世界范围的常见病,我国的发病率为0.3%～0.4%,西方国家发病率约为1%,其主要表现为慢性关节滑膜炎、多种炎性细胞浸润、关节软骨和骨组织的进行性破坏,同时伴有新血管显著增生和系统炎症的发生,未经系统治疗的RA可反复迁延多年,最终导致关节畸形和不同程度的功能丧失。由于RA的发病原因和病理机制还远未阐述清楚,临床上用于治疗RA的化学药主要用于控制症状,部分药物可延缓疾病进程,但起效慢,需要长期用药,往往出现较严重的不良反应,因此临床上尚无理想的治疗RA的药物。从中药白芍的干燥根中提取的有效部位——白芍总苷（total glucosides ofpaeony,TGP）,在临床上有较好地治疗RA的作用,且不良反应小。本课题组的早期研究发现TGP对角叉菜胶诱导的大鼠急性炎症和佐剂性关节炎（adjuvantarthritis,AA）大鼠的原发性、继发性炎症都有抑制作用:对免疫细胞和细胞因子如白介素-1（interleukin-1,IL-1）、白介素-2（interleukin-2,IL-2）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNFα）等具有功能依赖性双向调节作用。随后的研究发现,AA大鼠关节滑膜细胞中,抑制性G蛋白α亚基（inhibitoryαsubunit of G protein,Gαi）mRNA表达增加,激活性G蛋白α亚基（stimulatoryαsubunit of G protein,Gαs）mRNA表达降低,PGE2水平升高,环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）生成减少,滑膜细胞的增殖功能亢进,即G蛋白-AC-cAMP信号转导通路介导了大鼠AA的发病过程,进一步的研究发现,TGP可减少AA大鼠滑膜细胞分泌前列腺素E2（prostaglandins E2,PGE2）,抑制成纤维样滑膜细胞（fibroblast-likesynoviocytes,FLS）的过度增殖;TGP体外给药可抑制重组大鼠IL-1α（recombinantrat IL-1α,rIL-1α）刺激所引起的AA大鼠FLS中Gαi1、Gαi2和Gαi3的表达;并可降低由白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）刺激的胶原性关节炎（collageninduced arthritis,CIA）大鼠FLS中百日咳毒素（pertussis toxin,PT）催化的ADP-核糖基化水平,升高霍乱毒素（cholera toxin,CT）催化的ADP-核糖基化水平,调节G蛋白的活性。PGE2与RA发病密切相关,它和其相应受体（prostaglandins E2receptors,EP）结合后,与G蛋偶联,激活G蛋白信号通路,引起细胞内cAMP水平的变化,产生广泛的效应,而PGE2水平及其受体表达的变化,Gαi、Gαs表达的改变以及Gαs/Gαi平衡的失调,均会影响到细胞内的cAMP水平。那么,TGP是否作用于这些环节,从而发挥其对RA的治疗效应呢?因此,本实验采用大鼠佐剂性关节炎模型,以滑膜细胞为观察对象,深入探究AA大鼠滑膜细胞中PGE2-EP-G蛋白偶联信号通路的变化以及TGP的作用。目的:根据TGP对大鼠AA的关节肿胀、关节滑膜病理形态学的改善作用,分析TGP对滑膜细胞分泌功能与关节肿胀、细胞增殖与cAMP水平的相关性,并通过观察TGP对PGE2刺激所引起的FLS中IL-1β、cAMP水平的影响,明确PGE2对AA大鼠滑膜细胞增殖的影响;以AA发病的靶细胞——滑膜细胞上PGE2受体为突破口,选择滑膜细胞的PGE2-EP-G蛋白-cAMP信号转导为切入点,分析TGP是否通过影响AA大鼠滑膜细胞上的EP受体,并进而影响滑膜细胞G蛋白-cAMP信号通路而发挥其抑制滑膜细胞过度增殖的作用。方法:大鼠足跖皮内注射弗氏完全佐剂（Freund’s complete Adjuvant,FCA）诱发大鼠AA模型:以TGP 25、50、100 mg·kg-1治疗给药（ig,d14～d21）,雷公藤多苷（GTW）8 mg·kg-1作为阳性对照。足容积法测量继发侧足肿胀度;光学显微镜观察关节组织病理学变化;小鼠胸腺细胞增殖法测定滑膜细胞产生IL-1水平;放射性免疫法测定滑膜细胞中PGE2、cAMP、TNFα水平;MTT法检测FLS的增殖反应。采用Western blot技术检测滑膜组织中Gαs、Gαi1、EP亚型EP2、EP4的表达变化;免疫组化法检测滑膜组织Gαs、Gαi1的表达;放射性免疫法测定PGE2刺激AA大鼠滑膜细胞产生的IL-1β和cAMP水平。关节病理检测采用苏木素-伊红（hematoxylin-erosin,HE）染色,免疫组化检测采用S-P法。结果:1.TGP减轻AA大鼠关节肿胀与其抑制滑膜细胞分泌PGE2、IL-1和TNFα水平密切相关,提高细胞内cAMP水平是其发挥抑制滑膜过度增殖效应的重要方面采用注射FCA诱导大鼠AA模型,其继发性炎症反应表现为:对侧和前肢关节肿胀,耳、尾部出现炎性结节、红斑、活动障碍等症状。AA大鼠的关节病理变化主要表现为:滑膜组织增厚,由4～6层滑膜细胞组成,滑膜细胞多呈卵圆形,另有部分滑膜细胞呈绒毛状增生;关节周围组织充血、水肿,有炎性细胞浸润;关节软骨组织破损、剥脱,胶原纤维增生,有明显的血管翳形成。TGP(50,100 mg·kg-1,ig,d14～d21)可不同程度地减轻AA大鼠的足肿胀度;镜检发现,AA大鼠关节滑膜增生减弱,淋巴细胞浸润减少,血管翳形成减少,软骨受损程度减轻。TGP体内给药(50,100 mg·kg-1,ig,d14～d21)可显著抑制AA大鼠滑膜细胞培养上清中过高的PGE2、IL-1和TNFα水平,相关性分析表明,TGP减轻AA大鼠关节肿胀与其抑制滑膜细胞产生PGE2、IL-1和TNFα密切相关,其相关系数分别为0.9696、0.9639和0.9384。TGP体内给药(50,100 mg·kg-1,ig,d14～d21)和体外给药(62.5,125,250μg·ml-1)均可抑制AA大鼠FLS的过度增殖,升高细胞内cAMP水平,相关性分析表明TGP抑制AA大鼠FLS的增殖与其提高细胞内cAMP水平密切相关,其相关系数分别为-0.9956、-0.9877。2.抑制PGE2刺激成纤维样滑膜细胞分泌IL-1β、调节cAMP水平是TGP抑制滑膜细胞增殖的特点之一PGE2(10-7M)体外刺激FLS,短时间（1～4h）内可使cAMP水平升高,而PGE2的持续刺激则导致cAMP水平的显著下降;TGP体外给药(62.5,125,250μg·ml-1)可不同程度地抑制PGE2持续刺激所引起的IL-1β的产生,提高FLS中cAMP水平,表明抑制AA大鼠滑膜细胞亢进的分泌功能是TGP抑制增殖的重要特点。3.恢复AA大鼠滑膜细胞的PGE2-EP-G蛋白-cAMP信号转导是TGP抑制滑膜增殖的重要机制之一Western blot法检测结果发现,TGP体内给药(50,100 mg·kg-1,ig,d14～d21)能明显抑制AA大鼠滑膜组织Gαi1的表达,促进Gαs的表达,恢复Gαs/Gαi的平衡,促进EP亚型EP2、EP4的表达,提示:调节EP2、EP4的表达,维持Gαs/Gαi的平衡,恢复PGE2-EP-G蛋白-cAMP信号的正常转导,可能是TGP抑制AA大鼠滑膜增殖的重要机制之一。结论:1.TGP降低滑膜细胞分泌PGE2、IL-1和TNFα水平,提高细胞内cAMP水平是其缓解AA大鼠关节肿胀、抑制滑膜过度增殖的主要作用。2.TGP抑制PGE2刺激FLS产生IL-1β、提升PGE2持续刺激所降低的cAMP水平是其抑制AA大鼠滑膜细胞亢进的分泌功能、产生抗增殖效应的重要特点。3.TGP能够抑制AA大鼠滑膜组织Gαi1的表达,上调Gαs、EP2和EP4的表达,恢复Gαs/Gαi的平衡,使细胞内cAMP水平升高,从而降低滑膜细胞的增殖与分泌,表明调节PGE2-EP-G蛋白-cAMP信号转导的平衡,可能是TGP发挥抑制滑膜增殖的重要机制之一。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 2 实验材料
• 2.1 动物
• 2.2 药物
• 2.3 试剂
• 2.4 仪器
• 3 实验方法
• 3.1 大鼠AA模型的制备
• 3.2 动物分组与给药
• 3.3 病理组织学检查
• 3.4 滑膜细胞的分离与培养
• 3.4.1 滑膜组织的采集
• 3.4.2 滑膜细胞的培养
• 3.4.3 细胞活力检测
• 2的测定'>3.5 滑膜细胞上清液中IL-1、TNFα和PGE₂的测定
• 3.5.1 滑膜细胞上清液的制备
• 3.5.2 IL-1活性的测定
• 3.5.3 TNFα含量的测定
• 2含量的测定'>3.5.4 PGE₂含量的测定
• 3.6 成纤维样滑膜细胞的增殖反应
• 3.7 滑膜细胞CAMP含量的测定
• 2刺激下AA大鼠成纤维样滑膜细胞产生IL-1β和CAMP水平的检测'>3.8 PGE₂刺激下AA大鼠成纤维样滑膜细胞产生IL-1β和CAMP水平的检测
• 3.9 免疫组化检测
• 3.10 western blot法检测滑膜组织Gαil、Gαs、EP2、EP4的表达
• 3.10.1 滑膜组织蛋白的提取
• 3.10.2 蛋白定量
• 3.10.3 western blot的操作步骤
• 3.11 统计学处理
• 4 结果
• 4.1 TGP减轻AA大鼠关节肿胀与其抑制滑膜细胞分泌功能的关系
• 4.1.1 TGP对AA大鼠继发侧关节肿胀度的影响
• 4.1.2 TGP对AA大鼠关节病理组织学的影响
• 2、IL-1和TNFα水平的影响及其与足肿胀的关系'>4.1.3 TGP对AA大鼠滑膜细胞分泌PGE₂、IL-1和TNFα水平的影响及其与足肿胀的关系
• 4.2 TGP对大鼠成纤维样滑膜细胞增殖能力及CAMP水平的影响
• 4.2.1 TGP体内用药对大鼠成纤维样滑膜细胞增殖能力及cAMP水平的影响
• 4.2.2 TGP体外用药对大鼠成纤维样滑膜细胞增殖能力及cAMP水平的影响
• 2刺激下AA大鼠成纤维样滑膜细胞产生IL-1β、CAMP水平的影响'>4.3 TGP对PGE₂刺激下AA大鼠成纤维样滑膜细胞产生IL-1β、CAMP水平的影响
• 2刺激不同时间对AA大鼠成纤维样滑膜细胞产生cAMP水平的影响'>4.3.1 PGE₂刺激不同时间对AA大鼠成纤维样滑膜细胞产生cAMP水平的影响
• 2诱导AA大鼠成纤维样滑膜细胞产生IL-1β、cAMP水平的影响'>4.3.2 TGP对PGE₂诱导AA大鼠成纤维样滑膜细胞产生IL-1β、cAMP水平的影响
• 4.4 AA大鼠滑膜组织Gαs、Gαil的免疫组化及TGP的作用
• 4.5 炎症不同时期,AA大鼠滑膜组织Gαs和Gαil的蛋白表达
• 4.6 TGP对AA大鼠滑膜组织Gαs和Gαil表达的影响
• 4.7 TGP对AA大鼠滑膜组织EP2、EP4表达的影响
• 5 讨论
• 5.1 抑制AA大鼠滑膜细胞异常的分泌功能、提高滑膜细胞内CAMP水平是TGP缓解关节炎症、抑制滑膜过度增殖的重要作用
• 2刺激成纤维样滑膜细胞分泌IL-1β、调节CAMP水平是TGP抑制滑膜增殖的特点之一'>5.2 抑制PGE₂刺激成纤维样滑膜细胞分泌IL-1β、调节CAMP水平是TGP抑制滑膜增殖的特点之一
• 2-EP-G蛋白-CAMP信号的正常转导是TGP抑制关节炎滑膜过度增殖的重要机制之一'>5.3 调节EP2/EP4及Gαs/Gαi的表达平衡,恢复PGE₂-EP-G蛋白-CAMP信号的正常转导是TGP抑制关节炎滑膜过度增殖的重要机制之一
• 6 小结
• 7 参考文献
• 附录
• 致谢
• 2与类风湿关节炎及其药物?'>综述:前列腺素E₂与类风湿关节炎及其药物?