胶质母细胞瘤及其干细胞抵抗TRAIL诱导凋亡分子机制的研究

论文摘要

胶质母细胞瘤（glioblastoma）或称多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）,在胶质瘤中恶性程度最高,预后极差,目前各种治疗方法的效果均不理想。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL）是肿瘤坏死因子（TNF）超家族中的一员,它能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡,而对正常组织和细胞无明显毒性作用,这一特性使之成为肿瘤治疗研究中的热点。然而,在脑肿瘤研究中已证明,绝大部分GBM对TRAIL诱导凋亡发生抵抗,但其抵抗的分子机制目前尚不清楚。本实验采用体内实验与体外实验相结合的方法,应用细胞培养、酶联免疫吸附试验、流式细胞术、免疫磁珠分选、免疫荧光化学、Western blot及在体动物实验等技术,研究GBM单克隆细胞株对TRAIL诱导凋亡的敏感性,观察TRAIL凋亡蛋白表达及经TRAIL诱导各细胞株发生凋亡级联裂解反应。建立GBM肿瘤干细胞研究体系,研究GBM干细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性及TRAIL凋亡蛋白的表达情况。本研究旨在探讨GBM及其干细胞抵抗TRAIL诱导凋亡的分子机制,为脑肿瘤的治疗提供实验依据。本研究结果表明,GBM单克隆细胞株经TRAIL处理后可诱导凋亡,敏感细胞株半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）表达增高;而抵抗细胞株Caspase-8表达降低或不表达。敏感细胞株经TRAIL作用后引起Caspase-8、-3、-9及DFF-45裂解,抵抗细胞株不发生裂解。研究证明GBM干细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性降低,表达Caspase-8量减少;加入顺铂后GBM干细胞对TRAIL敏感性明显增加;加入Caspase-8抑制剂Z-IETD、Caspases广泛抑制剂Z-VAD后,可抑制GBM干细胞对TRAIL诱导的凋亡反应。这些结果表明,在GBM及其干细胞抵抗TRAIL诱导凋亡研究中,Caspase-8表达起重要作用,与TRAIL诱导凋亡抵抗有一定相关性,为脑肿瘤的治疗提供了新的理论依据。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩写词表
• 第1章 前言
• 1.1 TRAIL 在脑肿瘤治疗中的作用
• 1.1.1 TRAIL 及其受体的结构及功能
• 1.1.2 TRAIL 诱导凋亡的非线粒体信号转导路径
• 1.1.3 TRAIL 诱导凋亡的线粒体信号转导路径
• 1.1.4 TRAIL 和死亡复合体
• 1.1.5 Bcl-2 家族和 TRAIL
• 1.1.6 TRAIL 与化疗药物的联合作用
• 1.1.7 TRAIL 在脑肿瘤治疗中的意义
• 1.2 TRAIL 在脑肿瘤干细胞中的作用
• 1.2.1 脑肿瘤干细胞的特性
• 1.2.2 脑肿瘤干细胞的发生部位
• 1.2.3 脑肿瘤干细胞的分离
• 1.2.4 脑肿瘤干细胞表面标记物及分化标记物
• 1.2.5 脑肿瘤干细胞抵抗TRAIL 诱导凋亡的研究进展
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第2章 GBM 单克隆细胞株对TRAIL 敏感性的检测
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 实验材料及试剂
• 2.1.3 细胞来源
• 2.1.4 主要试剂配制
• 2.1.5 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 GBM 单克隆细胞株的挑选
• 2.2.2 GBM 单克隆细胞株对TRAIL 敏感性
• 2.2.3 检测GBM 单克隆细胞株TRAIL 凋亡蛋白表达
• 2.2.4 TRAIL 诱导凋亡后各细胞株 Caspases 及 DFF-45 裂解情况
• 2.3 讨论
• 第3章 GBM 神经球的分离、鉴定、纯化及对TRAIL 的敏感性
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 实验材料及试剂
• 3.1.3 细胞来源
• 3.1.4 主要试剂配制
• 3.1.5 实验方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 GBM 悬浮神经球的形成
• 3.2.2 第1 代GBM 神经球次级克隆形成率
• 3.2.3 第3 代和第7 代神经球单细胞克隆形成率的比较
• 3.2.4 GBM 神经球干细胞表面抗原特异性标记物的检测
• 3.2.5 GBM 神经球多分化潜能的检测
• 3.2.6 GBM 神经球经TRAIL 作用的细胞死亡率
• 3.2.7 不同代GBM 神经球中表达TRAIL 凋亡蛋白
• 3.2.8 小鼠致瘤实验
• 3.2.9 NOD/SCID 小鼠脑肿瘤原代细胞培养
• 3.3 讨论
• 第4章 CD133+/- GBM 干细胞对 TRAIL 的敏感性
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要仪器
• 4.1.2 实验材料及试剂
• 4.1.3 细胞来源
• 4.1.4 主要试剂配制
• 4.1.5 实验方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 GSC326、GSC189 细胞系中神经球生长情况
• 4.2.2 检测分选阳性率
• +/-亚群细胞的增殖能力'>4.2.3 分选后CD133^+/-亚群细胞的增殖能力
• +/-亚群细胞经TRAIL 作用的细胞死亡率'>4.2.4 检测CD133^+/-亚群细胞经TRAIL 作用的细胞死亡率
• +/-亚群细胞中表达TRAIL 蛋白情况'>4.2.5 检测CD133^+/-亚群细胞中表达TRAIL 蛋白情况
• 4.3 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附图
• 攻读博士期间发表的学术论文
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT