hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

论文摘要

RNA介导的病毒抗性是RNAi在植物抗病毒侵染中的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在PTGS所导致的RNA降解过程中,RNA降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因RNA一起降解。新的研究证明发生于不同物种上的RNA沉默的直接引发因子都是双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）,在不同生物中dsRNA有多种形成方式。对于转基因（正义和反义）来说,dsRNA最有效的形成途径是体外构建具有反向重复结构（Inverted Repeat, IR）的cDNA引入转基因植株,这种IR结构在体内转录后形成发夹RNA（hairpin RNA, hpRNA）。hpRNA中的dsRNA部分决定了反应的特异性,是诱发基因沉默的关键部位,它的长度和来源均影响所诱导的RNA沉默的效率。hpRNA间隔区段的长度可影响转基因转录后hpRNA的形成和稳定性,进而影响基因沉默的效率。一般认为短的间隔序列有利于hpRNA的形成,保持其高度稳定性,获得较高的沉默效率;但研究中也发现间隔序列过短往往影响IR序列在细菌内的稳定性,影响具反向重复结构基因的克隆。适宜的茎环比例,可能是获得高基因克隆效率和高基因沉默效率的关键。本研究选用了PVYNCP基因3’端50bp序列作为hpRNA的茎,以克隆载体pUC19不同长度的序列为环,构建了具有不同茎环比例的hpRNA结构的植物表达载体,转化烟草,研究了茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响。研究结果将为高效hpRNA的设计提供依据。具体结果如下:1.分别克隆PVYNCP 3’端704-754之间50bp的片断作为hpRNA结构的茎,以pUC19序列上的部分片段为hpRNA的环,构建植物双元表达载体pROK-4﹕1、pROK-2﹕1、pROK-1﹕1、pROK-1﹕2、pROK-1﹕4和pROK-1:8。2.将所构建的重组植物表达载体pROK-4﹕1、pROK-2﹕1、pROK-1﹕1、pROK-1﹕2、pROK-1﹕4和pROK-1﹕8及空pROKⅡ利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入农杆菌菌株。3.叶盘法转化烟草NC89。用卡那霉素对再生植株再次抗性筛选、PCR检测,共获得转pROKⅡ的烟草40株,转pROK-4:1的烟草143株,转pROK-2﹕1的烟草152株,转pROK-1﹕1烟草130株,转pROK-1﹕2的烟草135株;转pROK-﹕4的烟草132株;转pROK-1﹕8的烟草126株。4.转基因植株的抗病性分析,以PVYN的病汁液为接种物,汁液摩擦接种转基因烟草。症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVYN的抗性存在差异。从抗病性测试结果来看,在143株转pROK-4﹕1的T0代烟草中,有84株表现高度抗病,抗性植株比例为57.34%;152株转pROK-2﹕1的T0代烟草中,有94株表现高度抗病,抗性植株比例为61.84%;130株转pROK-1﹕1的T0代烟草中,有78株表现高度抗病,抗性植株比例为60.00%;135株转pROK-1﹕2的T0代烟草中,有69株表现高度抗病,抗性植株比例为51.11%;132株转pROK-1﹕4的T0代烟草中有72株表现高度抗病,抗性植株比例为44.69%;126株转pROK-1﹕8的T0代烟草中有12株表现高度抗病,抗性植株比例为9.52%。从发病的情况可以看出转基因植株中抗性植株的比例与茎环比例呈一定相关性。5.分别选取抗病性表现不同（抗病和感病）的部分转基因植株提取总DNA进行Southern blot分析,分析转基因的拷贝数与抗病性间的关系。结果表明转基因的拷贝数与抗病性无明显的相关性。6.转基因植株的Northern blot分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病性与转基因转录产物的积累量二者呈负相关,即这种抗病性为RNA介导的抗病性,是RNA沉默的结果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 1 引言
• 1.1 RNAi 的研究背景
• 1.2 RNAi 系统的特征
• 1.2.1 RNAi 作用的靶基因位点有选择性也就是序列特异性
• 1.2.2 RNAi 的作用迅速，效率高
• 1.2.3 RNAi 作用需要ATP
• 1.2.4 具有高稳定性
• 1.2.5 可传播性和可遗传性
• 1.2.6 RNAi 效应的依赖性
• 1.2.7 周期短，方法简便，操作简单
• 1.3 RNA 介导的病毒抗性
• 1.3.1 RNA 介导的病毒抗性的特点
• 1.3.2 RNA 介导的病毒抗性是转录后基因沉默的结果
• 1.4 RNAi 的机制及其相关的酶
• 1.5 植物中 RNAi 介导方法
• 1.5.1 病毒介导法
• 1.5.2 hpRNA 介导法
• 1.6 hpRNA 与RNA 介导的基因沉默
• 1.7 本研究的立题依据和主要研究内容
• 1.7.1 立题依据
• 1.7.2 本研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒源
• 2.1.2 供试植物
• 2.1.3 菌株、质粒
• 2.1.4 常用缓冲液及培养基的配制
• 2.1.5 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 不同目的片段的获得
• 2.2.1.1 引物设计
• 2.2.1.2 PCR 扩增目的片段
• 2.2.2 中间载体pUC19-550 和pROKII-550 的构建
• 2.2.2.1 506p 的DNA 片段和pUC19、pROK II 质粒的酶切
• 2.2.2.2 506p 的DNA 片段分别和pUC19、pROK II 质粒的连接
• 2.2.2.3 感受态细胞的制备
• 2.2.2.4 质粒DNA 向大肠杆菌中转化（热激法）
• 2.2.2.5 转化菌落PCR 鉴定
• 2.2.2.6 质粒DNA 的大量提取（碱裂解法）
• 2.2.2.7 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.3 植物表达载体的构建
• 2.2.3.1 植物表达载体的构建策略
• 2.2.3.2 不同长度的目的片段与中间载体pROKII-550 的连接
• 2.2.3.3 含有不同反向重复结构的重组质粒向大肠杆菌的转化（热激法）
• 2.2.3.4 含有不同反向重复结构的重组质粒转化菌落的PCR 鉴定
• 2.2.3.5 含有不同反向重复结构的重组质粒 DNA 的大量提取（碱裂解法）
• 2.2.3.6 含有不同反向重复结构的重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.3.7 含有不同反向重复结构的重组质粒向农杆菌转化（冻融法）
• 2.2.4 目的基因向烟草中的转化及植株再生
• 2.2.5 植物总DNA 的提取（C11AB 法）及PCR 检测
• 2.2.5.1 植物总DNA 的提取（cTAB 法）
• 2.2.5.2 转基因植株的PCR 检测
• 2.2.6 转基因植株的抗病性鉴定及ELISA 检测
• 2.2.6.1 转基因植株的抗病性鉴定
• 2.2.6.2 ELISA 检测
• 2.2.7 转基因植物的Southern blot 分析
• 2.2.7.1 植物总DNA 的酶切
• 2.2.7.2 DNA 凝胶电泳
• 2.2.7.3 转膜
• 2.2.7.4 探针的制备
• 2.2.7.5 杂交
• 2.2.8 转基因植株总RNA 的提取及Northern blot 分析
• 2.2.8.1 植物总RNA 的提取（Trizol 一步提取法）
• 2.2.8.2 在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳
• 2.2.8.3 转膜
• 2.2.8.4 探针制备
• 2.2.8.5 杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 目的片段的获得
• 3.1.1 目的片段的扩增和酶切
• 3.1.2 质粒DNA 酶切
• 3.2 重组克隆载体的构建
• 3.2.1 重组中间载体pUC19-550 和pROKII-550 的菌落PCR 鉴定
• 3.2.3 重组中间载体pUC19-550 和：pROK II-550 质粒的酶切鉴定
• 3.2.4 pROK-4:1、pROK-2:1、pROK-1:1、pROK-1:2、 pROK-1：4 和pROK-1：8 植物表达载体的菌落PCR 鉴定
• 3.3 转化植株的获得
• 3.4 转化植株的PCR 检测
• 3.5 转基因植株的抗病性分析
• 3.6 转基因植株的SOUTHERN BLOT 分析
• 3.6.1 转基因（非转基因）植株DNA 的酶切
• 3.6.2 转基因烟草的Southern blot，分析
• 3.7 转基因植株的Northem blot 分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录I 常用缓冲液及培养基的配制
• 附录II 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录III 质粒图谱
• 致谢
• 硕士研究生阶段发表的论文