论文摘要
目的细胞周期调控机制的紊乱,导致细胞无限制地增殖,是恶性肿瘤发生的主要机制之一。参与细胞周期调控的因子有多种, Skp2为其中一种,它作为一种新的癌基因,已成为人们日益关注的焦点。Skp2也是APC-Cdh1的关键底物之一。APC-Cdh1虽在细胞周期调控中发挥着重要作用,但下调APC-Cdh1是否引起增殖细胞凋亡及如何影响细胞周期,尚不确定。故本实验构建Cdh1小干扰RNA载体,并将其转染至Hela细胞中,对其表达进行鉴定,下调APC-Cdh1检测相关蛋白Skp2的变化,并探讨下调APC-Cdh1对Hela细胞周期的影响。方法1. Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定根据pENTRTM/H1/TO中间载体要求,设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,退火后连接到pENTRTM/H1/TO线性载体,形成完整载体,进行测序鉴定。分别将测序鉴定成功的Cdh1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染Hela细胞,转染后48 h提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用实时定量PCR和Western blot检测Cdh1的表达。2.下调APC-Cdh1对Hela细胞周期的影响将成功构建的Cdh1小干扰RNA载体转染至Hela细胞中,24h后,分别加入Zeocin 300 mg/L进行筛选,将筛选成功的细胞扩增培养,用流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡,AnnexinⅤFITC/PI共染检测细胞凋亡,Brdu标记法检测细胞增殖能力,实时定量PCR检测Skp2的表达。结果1.经测序鉴定成功构建Cdh1小干扰RNA载体和对照载体,分别命名为pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol。与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比,转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达降低（P<0.05）。2.与转染pENTR/shcontrol相比,转染pENTR/shCdh1的Hela细胞G0-G1期细胞所占比例减少,S期细胞增多,两组细胞凋亡率差异无统计学意义;Brdu标记法检测细胞阳性率增加;Skp2的表达量也增加。结论成功构建Cdh1小干扰RNA载体,并能下调Hela细胞Cdh1的表达。下调Cdh1-APC可使进入S期的细胞增多,而对细胞凋亡无明显影响。