鹅肥肝中差异表达基因的筛选及分析

论文摘要

为了探索鹅肥肝形成的分子机理,本研究以12只朗德鹅为试验材料,分填肥组和对照组,每组6只,运用mRNA差异显示（DDRT-PCR）技术,检测填肥组和对照组之间的差异表达片段,将所获得的差异片段克隆测序后与GenBank中已知基因进行序列比对,寻找差异片段的同源基因或序列,并推测差异表达基因的功能。另外,由于鹅肥肝的形成与脂肪代谢密切相关,本研究还选择了7个脂肪性状的候选基因:脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（Adipocyte fatty acid binding protein, A-FABP）、肝脏型脂肪酸结合蛋白（liver fatty acid binding protein, L-FABP）、过氧化物酶体增殖物受体α（proxisome proliferators-activated receptor alpha, PPARα）和γ（proxisome proliferators-activated receptor gmma, PPARγ）、脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase, LPL）、肝X受体-α（liver X receptor-α, LXRα）及脂联素（aidponectin, AdipoQ）,利用半定量RT-PCR技术检测候选基因和新获得的差异表达基因在鹅肥肝中的表达水平,探讨它们在肥肝形成中的作用机理。结果如下:（1）用90对引物组合在填肥组和对照组间检测到40条差异表达片段,经片段回收、二次PCR及克隆测序后共成功获得了22条差异片段序列。经序列比对,在22条差异表达片段中,发现了8条与已知功能基因高度同源;6条与已知EST序列或cDNA序列同源,但其功能未知;8条在GenBank中没有找到相似序列,归为新EST序列。（2） 8条已知功能的差异表达基因为:纤维蛋白原α（fibrinogen alpha chain , FGA）基因、纤维蛋白素原γ（fibrinogen gamma chain, FGG）基因、色素框同源物6（Chromobox homolog 6, CBX6）基因、RNA结合基序7（RNA binding motif protein7, RBM7）基因、跨膜蛋白53（transmembrane protein 53, TMEM53）基因、基质金属蛋白酶11（matrix metallopeptidase-11, MMP-11 ）基因、C18orf1基因和锌指蛋白469（zinc finger protein 469, ZNF469）基因。（3） DDRT-PCR结合半定量RT-PCR检测发现,在鹅肥肝中表达上调的基因有FGA、CBX6、TMEM53、MMP-11、ZNF469、A-FABP、L-FABP和PPARγ基因。而呈现下调趋势的有5条基因,它们是编码FGG、RBM 7、C18orf1、PPARα和LPL的基因。另外,LXRα基因在对照组和填肥组肝脏之间没有显著的表达差异,AdipoQ基因在两组间均不表达。（4）上述基因与脂肪代谢、肿瘤的转移、RNA修饰及调控有密切的关系,在强饲的高能饲料诱导下,这些基因在肝脏中的特异性表达变化可能是促进鹅肝脏中脂肪沉积的重要因素,可以将它们作为鹅肥肝形成的候选基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 鹅肥肝研究现状
• 1.1.1 肥肝形成的分子机理研究进展
• 1.1.2 与脂肪代谢相关基因的研究进展
• 1.2 mRNA 差异显示技术的原理与应用
• 1.2.1 DDRT-PCR 技术的原理与方法
• 1.2.2 DDRT-PCR 技术的优缺点和改进
• 1.2.3 DDRT-PCR 技术的应用
• 1.3 本实验的目的、意义和主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 朗德鹅的分组、填肥和取样
• 2.1.2 主要试验仪器设备
• 2.1.3 主要药品及试剂的配制
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 主要分子生物学软件和互联网资源
• 2.2 实验方法及步骤
• 2.2.1 RNA 的提取和保存
• 2.2.2 cDNA 第一链的获得
• 2.2.3 差异显示PCR
• 2.2.4 1.5%琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.5 7%聚丙烯酰胺凝胶制备和电泳
• 2.2.6 差异表达片段的回收及二次PCR
• 2.2.7 差异表达片段PCR 产物的纯化
• 2.2.8 差异表达片段的克隆
• 2.2.9 差异表达片段的序列测定及分析
• 2.2.10 半定量RT-PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 朗德鹅的填肥效果
• 3.2 肝脏组织总RNA 的提取和检测结果
• 3.3 mRNA 差异显示结果
• 3.4 差异表达片段的切胶回收
• 3.5 差异表达片段的二次PCR 与纯化
• 3.6 差异表达片段的克隆、测序
• 3.7 差异表达片段的序列分析
• 3.8 半定量RT-PCR 检测结果
• 3.8.1 线性增长试验
• 3.8.2 半定量RT-PCR 扩增结果
• 4 讨论
• 4.1 朗德鹅的填肥
• 4.2 mRNA 差异显示技术优化
• 4.2.1 总RNA 的提取
• 4.2.2 DDRT-PCR 引物及反应条件的优化
• 4.2.3 差异表达片段的重复性及验证
• 4.3 肥肝形成中差异表达基因的筛选
• 4.4 肥肝形成中基因的差异表达和调控
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的文章及序列目录