马铃薯晚疫病水平抗性相关基因诱导表达谱及水平抗性机制初探

论文题目: 马铃薯晚疫病水平抗性相关基因诱导表达谱及水平抗性机制初探

论文类型: 博士论文

论文专业: 蔬菜学

作者: 王冰林

导师: 谢从华

关键词: 马铃薯,晚疫病菌,水平抗性,微阵列,防卫代谢,防卫反应,表达模式,信号途径

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 马铃薯(Solanum tuberosum L.)是国际上第四大粮食作物。由致病疫霉菌(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是世界农业生产中最具破坏性的植物病害之一，在世界各地广为流行，晚疫病防治一直为国际社会所关注。由于水平抗性是由微效多基因控制的非小种专化抗性，抗性较为持久、稳定，所以选育广谱、持久的水平抗性品种已成为马铃薯晚疫病抗性育种的必然趋势。目前，研究人员已开展了水平抗性相关的数量性状位点(QTL)的定位以及差异表达基因分离、鉴定等工作，但这些基因在晚疫病菌侵染期间的动力学表达模式、参与的防卫代谢途径和调控机制以及水平抗性信号传导网络尚不清楚。为此，本研究应用cDNA微阵列技术，综合分析了1009条马铃薯晚疫病水平抗性相关的表达序列标签(ESTs)在晚疫病菌和不同非生物因子处理下的动态表达模式，并比较了这些ESTs在不同抗性马铃薯品种(系)中的表达差异，旨在揭示晚疫病水平抗性的分子基础，为有效利用水平抗性提供理论依据与技术策略。主要研究结果如下： (1) 以水平抗性马铃薯品系(QR；CIP Code：386209.10)叶片为材料，全面分析了1009条ESTs在晚疫病菌侵染过程中的动态表达模式。以每个样点在接种与对照样品中的杂交信号比值>2.2为标准，筛选出669个显著差异表达ESTs，经测序、比对、合并重复类型后，共得到348个代表不同基因的非重复序列片段(Singleton EST)，其中234个与已知功能基因(或ESTs)具有显著序列相似性，而其它114个则被暂定为未知功能ESTs(约占32.8％)。234个已知功能ESTs分属于13个功能类别，即细胞防御、初级代谢、次级代谢、能量代谢、信号传导、转录调控、蛋白质合成、蛋白质降解、细胞运输、细胞结构、结合功能蛋白、系统性反应和发育。根据鉴定基因的病原诱导表达模式，可将马铃薯对晚疫病菌的防卫过程大致区分为三个明显时期，从而在分子水平上初步揭示了晚疫病菌侵染马铃薯叶片的自然过程，并预测了这些事件发生的时间顺序以及参与每个阶段的基因。这些基因的病原诱导表达谱可作为马铃薯防御机制深入研究的重要平台，并可为确定晚疫病水平抗性候选基因及其参与的防御路径、调控机制等研究提供线索。 (2) 在上述348个晚疫病抗性相关基因中，包括98个代谢相关基因。根据这些基因在晚疫病菌侵染后的动态表达模式，初步推断，共有11条代谢途径可被晚疫病菌诱导激活，即莽草酸途径、苯丙烷类途径、氧合脂类途径、多胺合成与降解途径、生物碱合成途径、乙烯(ET)合成途径、糖酵解途径、类异戊二烯途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环和乙醛酸循环途径。这些代谢相关基因各自具有的特异性诱导表达模式暗示了上述途径可能在相互联系、彼此协调的代谢网络中发挥作用，从而共同参与了马铃薯抵御晚疫病菌侵染过程。位于上游的糖酵解和莽草酸途径对于满足下游的三羧酸循环、类异戊二烯、生物碱合成和苯丙烷类等代谢途径所需的底

论文目录:

目录

缩略词表

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1.1 马铃薯晚疫病菌概述

1.1.1 病原菌基本特征特性

1.1.2 生理小种变异

1.1.2.1 垂直抗性品种的推广

1.1.2.2 A2交配型的出现与有性生殖

1.1.2.3 抗药性小种的产生

1.1.2.4 晚疫病菌大迁移

1.2 马铃薯晚疫病抗性分子遗传学研究

1.2.1 垂直抗性

1.2.1.1 R基因的染色体定位

1.2.1.2 R基因克隆

1.2.2 水平抗性

1.2.2.1 QTL定位

1.2.2.2 差异表达基因分离

1.2.3 垂直抗性与水平抗性的再认识

1.3 马铃薯晚疫病抗性基因工程研究

1.3.1 抗病基因遗传转化

1.3.2 防卫基因遗传转化

1.3.3 利用基因工程培育植物抗病品种的发展策略

1.4 植物—病原互作中寄主次级代谢变化及调节

1.4.1 苯丙烷类代谢

1.4.2 类异戊二烯代谢

1.4.3 氧合脂类代谢

1.4.4 生物碱合成

1.5 植物—病原互作中的信号识别与传导

1.5.1 信号识别

1.5.2 信号传导

1.5.2.1 SA介导的信号传导

1.5.2.2 JA介导的信号传导

1.5.2.3 ET介导的信号传导

1.5.2.4 一氧化氮、活性氧和脱落酸介导的信号传导

1.5.2.4.1 NO介导的信号传导

1.5.2.4.2 ROS介导的信号传导

1.5.2.4.3 ABA介导的信号传导

1.5.2.5 R基因介导的信号传导

1.5.2.6 植物防御反应信号传导途径的互作

1.5.2.6.1 JA与ET信号传导途径的互作

1.5.2.6.2 JA与SA信号传导途径的互作

1.5.2.6.3 SA与ET信号传导途径的互作

1.6 基因芯片技术及其在植物研究中的应用

1.6.1 基因芯片技术的原理、特点及分类

1.6.2 基因芯片数据分析

1.6.2.1 数据标准化

1.6.2.2 标准化数据的统计学分析

1.6.2.2.1 差异表达分析

1.6.2.2.2 聚类分析

1.6.3 基因芯片技术的应用

1.6.3.1 DNA序列分析

1.6.3.2 基因表达模式研究及特异性基因鉴定

1.6.3.3 基因差异表达分析

1.6.3.4 突变体检测

1.6.3.5 转基因植株检测

1.6.4 展望

1.7 本研究的目的与内容

第二章 材料与方法

2.1 植物材料

2.2 晚疫病菌培养与接种

2.2.1 晚疫病菌培养

2.2.1.1 培养基繁殖法

2.2.1.2 块茎薄片培养法

2.2.2 离体叶片接种

2.3 cDNA芯片制备

2.3.1 对照基因

2.3.2 EST扩增与精制

2.3.3 点样及其后处理

2.4 RNA抽提

2.5 荧光探针标记

2.6 芯片杂交、洗涤和扫描

2.7 数据分析

第三章 马铃薯晚疫病水平抗性相关基因Phytophthora infestans诱导表达模式

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 植物材料

3.2.2 晚疫病菌接种

3.2.3 EST测序、检索及功能分类

3.2.4 RT-PCR分析

3.3 结果

3.3.1 晚疫病菌培养与叶片接种

3.3.2 叶片总RNA抽提

3.3.3 芯片杂交结果可靠性分析

3.3.3.1 自身比较实验

3.3.3.2 差异分析实验

3.3.3.2.1 Cy3、Cy5正反向标记芯片杂交重复性比较

3.3.3.2.2 Cy3、Cy5同向标记芯片杂交重复性比较

3.3.3.2.3 芯片杂交片内重复性比较

3.3.4 晚疫病菌诱导ESTs的芯片杂交鉴定

3.3.5 晚疫病菌诱导ESTs的功能分类

3.3.6 晚疫病抗性相关基因病原诱导表达总模式

3.3.7 晚疫病抗性相关基因表达聚类分析

3.3.8 芯片杂交结果验证

3.4 讨论

3.4.1 芯片数据可靠性

3.4.2 马铃薯抵御晚疫病菌侵染的阶段划分

3.4.3 信号传导和转录调控相关基因的诱导表达

3.4.4 晚疫病菌对马铃薯防卫相关基因的调控

3.4.5 马铃薯非小种专化抗性中HR相关基因的诱导表达

3.4.6 晚疫病菌对马铃薯代谢相关基因的调控

3.5 小结

第四章 马铃薯晚疫病水平抗性相关代谢途径分析

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.3.1 晚疫病菌诱导基因表达的动力学模式

4.3.2 代谢相关基因的转录变化与代谢途径

4.4 讨论

4.4.1 持家代谢向防卫代谢的转变

4.4.2 连接初级代谢与次级代谢的桥梁—莽草酸途径

4.4.3 氧合脂类代谢途径的激发

4.4.4 多胺代谢与乙烯生物合成

4.4.5 能量代谢相关路径

4.5 小结

第五章 水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利对马铃薯晚疫病水平抗性相关基因的诱导表达分析

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 植物材料

5.2.2 SA、MJ和ETH处理

5.3 结果

5.3.1 晚疫病抗性相关基因在SA、MJ和ETH处理下的诱导表达模式

5.3.2 SA、MJ与ETH诱导表达基因

5.3.3 晚疫病菌“特异诱导表达基因”

5.4 讨论

5.4.1 SA、JA和ET信号途径在马铃薯晚疫病水平抗性中的协同作用

5.4.2 马铃薯防御晚疫病菌侵染过程中SA、JA和ET信号途径的形成与整合

5.4.3 马铃薯晚疫病抗性反应可能涉及的信号传导组分

5.4.4 马铃薯防御晚疫病菌侵染的其它信号途径?

5.5 小结

第六章 马铃薯晚疫病水平抗性相关基因对机械伤害及ABA处理的应答分析

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 植物材料

6.2.2 ABA、机械伤害处理

6.3 结果

6.3.1 晚疫病抗性相关基因对ABA、机械伤害的应答表达谱

6.3.2 ABA、机械伤害诱导表达基因

6.3.3 ABA抑制表达基因

6.3.4 晚疫病菌“特异诱导表达基因”

6.4 讨论

6.4.1 马铃薯对机械伤害及晚疫病菌应答反应的一致性

6.4.2 ABA在马铃薯防卫反应中的调节作用

6.4.3 植物防卫反应与胁迫反应之间的交互作用

6.5 小结

第七章 马铃薯晚疫病水平抗性相关基因在不同抗性品种(系)中的差异表达分析

7.1 前言

7.2 材料与方法

7.2.1 植物材料

7.2.2 晚疫病菌接种

7.3 结果

7.3.1 不同抗性马铃薯叶片晚疫病菌侵染症状

7.3.2 晚疫病水平抗性相关基因在不同马铃薯品种(系)中的P.infestans诱导表达谱

7.3.3 不同马铃薯品种(系)中被晚疫病菌诱导表达基因

7.4 讨论

7.4.1 晚疫病抗性相关基因在不同马铃薯品种(系)中的差异表达

7.4.1.1 调节基因的差异表达

7.4.1.2 功能蛋白基因的差异表达

7.4.2 仅在水平抗性马铃薯品系中被晚疫病菌显著诱导表达的基因

7.5 小结

第八章 总结与讨论

8.1 马铃薯晚疫病水平抗性相关基因在不同处理和不同品种(系)中的诱导表达比较

8.2 马铃薯晚疫病水平抗性机制

8.3 马铃薯晚疫病水平抗性与垂直抗性机制比较

8.4 研究展望

参考文献

附录1 通过cDNA微阵列杂交鉴定的马铃薯晚疫病菌应答ESTs和晚疫病菌ESTs列表

附录2 被晚疫病菌调控的马铃薯初级、次级与能量代谢相关基因汇总表

附录3 348个马铃薯晚疫病水平抗性相关基因在不同处理和不同品种(系)中的诱导表达比较

附录4 348个马铃薯晚疫病水平抗性相关ESTs编号与其GenBank登录号对照表

附录5 博士在读期间已发表和正在整理的文章

致谢

发布时间: 2006-12-12

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